Geosmin unterdrückt Abwehrverhalten und löst bei Honigbienen ungewöhnliche neuronale Reaktionen aus

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3851 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Geosmin ist ein Geruchsstoff, der von Bakterien in feuchten Böden produziert wird. Es wurde festgestellt, dass es für einige Insekten außerordentlich relevant ist, die Gründe dafür sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Hier berichten wir über die ersten Tests zur Wirkung von Geosmin auf Honigbienen. Ein Stechtest zeigte, dass das durch die Alarmpheromonkomponente Isoamylacetat (IAA) der Biene hervorgerufene Abwehrverhalten durch Geosmin stark unterdrückt wird. Überraschenderweise ist die Unterdrückung jedoch nur bei sehr niedrigen Geosminkonzentrationen vorhanden und verschwindet bei höheren Konzentrationen. Wir untersuchten die zugrunde liegenden Mechanismen auf der Ebene der Geruchsrezeptorneuronen mittels Elektroantennographie und stellten fest, dass die Reaktionen auf Mischungen aus Geosmin und IAA geringer ausfielen als auf reines IAA, was auf eine Wechselwirkung beider Verbindungen auf der Ebene der Geruchsrezeptoren schließen lässt. Die Kalziumbildgebung des Antennenlappens (AL) ergab, dass die neuronalen Reaktionen auf Geosmin mit zunehmender Konzentration abnahmen, was gut mit dem beobachteten Verhalten korrelierte. Die computergestützte Modellierung der Geruchstransduktion und -kodierung im AL legt nahe, dass eine umfassendere Aktivierung von Geruchsrezeptortypen durch Geosmin in Kombination mit lateraler Hemmung zu den beobachteten nichtmonotonen ansteigenden und abfallenden Reaktionen auf Geosmin führen und somit der Spezifität der Verhaltensreaktion zugrunde liegen könnte niedrige Geosminkonzentrationen.

Geosmin ist eine muffige, erdig riechende Verbindung, die von mehreren Mikroorganismen aus verschiedenen Klassen wie Cyanobakterien, Actinobakterien (z. B. Streptomyces sp.), Protozoen, Schimmelpilzen und Pilzen produziert wird1,2. Actinobakterien (einschließlich Streptomyces) werden häufig mit Hymenopterennestern in Verbindung gebracht, die sie dank ihrer natürlichen Produktion von Antibiotika wahrscheinlich vor Krankheitserregern schützen3,4,5. Eine aktuelle Studie ergab, dass Feuerameisenköniginnen (Solenopsis invicta) neue Nester bevorzugt in Böden anlegen, die reich an Actinobakterien sind. Diese Anziehungskraft wurde teilweise durch Geosmin vermittelt und führte zu einer höheren Überlebensrate der Königin6. Geosmin ist auch für andere Insekten ökologisch wichtig, etwa für die Essigfliege Drosophila melanogaster und die Mücke Aedes aegypti. Allerdings ruft es bei diesen Arten völlig unterschiedliche Reaktionen hervor. Geosmin löst bei D. melanogaster eine starke Abneigung aus, selbst in Gegenwart attraktiver Verbindungen7,8. Dies könnte dazu dienen, die Eiablage auf schimmeligen, ungeeigneten Früchten zu vermeiden8 oder um einen besseren Kontrast zu heruntergefallenen reifen Früchten zu schaffen und so die Suche effizienter zu gestalten9. In Ae. Aegypti hingegen ist Geosmin ein starker Lockstoff10. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass es das Vorhandensein von feuchtem Boden anzeigt, in den Eier gelegt werden können. Tatsächlich ist Geosmin auch als einer der Hauptbestandteile von Petrichor bekannt, dem „Geruch feuchter Erde“2.

Im ersten olfaktorischen Gehirnzentrum von Insekten, dem Antennenlappen (AL), rufen die meisten Gerüche ein kombinatorisches Muster glomerulärer Reaktionen hervor11,12. Allerdings aktivieren manche Gerüche, oft mit hoher biologischer Relevanz (z. B. Sexualpheromone), nur ein einzelnes Glomerulus. Wenn diese Reaktion auch in höheren Gehirnzentren unabhängig verarbeitet wird, was zu stereotypen Verhaltensreaktionen führt, wird der Schaltkreis als beschriftete Linie12 bezeichnet. Geosmin ist eine der wenigen Verbindungen, die bei D. melanogaster und Ae nur einen einzigen Glomerulus aktiviert. Aegypti-Mücken8,10. Bei Fliegen erfolgt die Verarbeitung weiter funktionell getrennt in höheren Gehirnzentren, wo sie Vorrang vor anderen Geruchssignalen hat, um ein Vermeidungsverhalten auszulösen8.

Trotz der ökologischen Relevanz von Geosmin für viele Insektenarten wurden Verhaltens- und physiologische Reaktionen auf diesen Geruch bei der Honigbiene Apis mellifera bisher nicht untersucht. Hier stellen wir die ersten Daten zur Beantwortung dieser Frage bereit. Diese Arbeit wurde durch die Frage motiviert, ob Geosmin, das für Menschen ein olfaktorischer Hinweis auf bevorstehenden Sommerregen ist, auch ein Wetterindikator für Honigbienen sein könnte13. Wenn ja, sollte es das Bienenverhalten modulieren, da über wetterabhängige Auswirkungen auf ein breites Spektrum von Bienenverhalten berichtet wurde, auch für Aktivitäten im Bienenstock14. Verhaltensänderungen bei Sammlern scheinen sogar Wetteränderungen vorwegzunehmen15.

Ein möglicher Einfluss auf das Abwehrverhalten wurde bislang kaum untersucht. Obwohl es Hinweise darauf gibt, dass das Stechen unter heißen und feuchten Bedingungen zunimmt16,17, bestätigen die Berichte von Apidologen diese Beobachtungen nicht unbedingt. Wir haben uns entschieden, in diesem Zusammenhang den Einfluss von Geosmin auf das Abwehrverhalten zu untersuchen.

Honigbienen verteidigen ihr Volk, indem sie potenzielle Eindringlinge stechen, ein Verhalten, das durch die Anwesenheit des von anderen Bienenvolksmitgliedern freigesetzten Alarmpheromons stimuliert wird18. Wir haben dieses Verhalten im Labor mit einem bewährten Stichtest getestet19. Darüber hinaus suchten wir nach neuronalen Korrelaten für das Verhalten auf der Ebene der olfaktorischen Rezeptorneuronen mittels Elektroantennographie und auf der Ebene der Antennenlappenprojektionsneuronen mittels In-vivo-Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung20 der durch Geosmin ausgelösten Aktivität. Schließlich verwendeten wir ein Spiking-Neuronales-Netzwerk-Modell, um zu untersuchen, wie sich die beobachteten, teilweise ungewöhnlichen neuronalen Reaktionen auf das aktuelle Verständnis des Geruchssystems der Biene auswirken.

Das Stechverhalten einer Bienendyade gegenüber einer schwarzen rotierenden Puppe, die in einer Arena präsentiert wurde, wurde unter Einwirkung verschiedener Geruchsreize beobachtet. In einer Kontrollgruppe wurden Bienen reinem Mineralöl ausgesetzt. In dieser Gruppe zeigte in 15 % der Versuche mindestens eine der beiden Bienen ein Stechverhalten gegenüber der Puppe (Abb. 1a, Zusatzfilm 1). Wenn Bienen in der Arena Geosmin ausgesetzt waren, war kein Einfluss auf die Häufigkeit des Stechverhaltens zu beobachten. Wenn Bienen stattdessen Isoamylacetat (IAA, in einer Konzentration von 10–1), einem Wirkstoff des Alarmpheromons der Bienen21, ausgesetzt wurden, erhöhte sich das Stechverhalten deutlich auf 50 % Stechverhalten (t(47) = 3,3, p = 0,002). ) wie erwartet (Abb. 1b).

Eine niedrige Geosminkonzentration verhindert die Rekrutierung von IAA zum Stechverhalten. (a) Schematische Darstellung des Verhaltenstests. Einer Bienendyade wurde eine rotierende Puppe präsentiert, mit der sie wählen konnten, ob sie stechen wollten oder nicht. Die roten Pfeile markieren die Eintrittspunkte des Luftstroms, der die Gerüche in die Arena trägt. (b) Häufigkeit von Versuchen, bei denen mindestens eine der Bienen Stechverhalten zeigte (n = 48 Bienendyaden pro Gruppe). MO: Mineralöl (Lösungsmittelkontrolle); Geo 10−x: Geosmin bei Konzentration 10−x; IAA 10–1: Isoamylacetat in einer Konzentration von 10–1. Die mit demselben Buchstaben gekennzeichneten Gruppen unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (GLM, korrigiert um mehrfache Vergleiche mit einem FDR-Verfahren).

Wenn Bienen einer Mischung aus IAA und einer geringen Konzentration an Geosmin (10–6) ausgesetzt wurden, konnten mit einer Stichwahrscheinlichkeit von 25 % deutliche Anzeichen einer Wechselwirkung zwischen beiden Reizen beobachtet werden, was im Vergleich zu einer deutlichen Verringerung der Häufigkeit dieses Verhaltens bedeutet Bienen, die nur IAA ausgesetzt waren (t(47) = 2,4, p = 0,02). Es gab keinen signifikanten Unterschied mehr zur Mineralölkontrolle (t(47) = 1,1, p = 0,27, Abb. 1b).

Wenn die Geosmin-Konzentration in der Mischung jedoch 10–3 betrug, wurde in 40 % der Fälle ein Stechen beobachtet, was sich nicht wesentlich vom Verhalten der Bienen unterschied, die nur mit IAA stimuliert wurden (t(47) = 0,6, S = 0,57). Tatsächlich war diese Stechhäufigkeit erneut deutlich höher als bei Kontrollbienen (t(47) = 2,9, p = 0,006), was darauf hindeutet, dass das Verhalten in diesem Fall durch die Reaktion auf IAA bestimmt wurde (Abb. 1b).

Wir begannen mit der Suche nach neuronalen Korrelaten der Verhaltenswirkung von Geosmin in Kombination mit IAA an der Peripherie des olfaktorischen Systems und zielten dabei auf die olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs) in den Antennen ab. Die Elektroantennographie misst eine Spannungsänderung zwischen Elektroden an jedem Ende der Antenne als Reaktion auf eine Geruchsexposition. Dieses Signal, eine lokale Feldpotentialaufzeichnung, hat eine Amplitude, die proportional zur Summe der in allen ORNs hervorgerufenen Aktivität ist. In unserem Experiment wurden Antennen von Honigbienen (n = 24) Geosmin in vier logarithmisch variierenden Konzentrationen von 10–6 bis 10–3, zwei IAA-Konzentrationen: 10–3 und 10–1 sowie Mischungen beider Gerüche ausgesetzt in all diesen Konzentrationen. Ein Beispiel für die Signale, die eine einzelne Biene als Reaktion auf die verschiedenen Reize erhält, ist in Abb. 2a dargestellt. Die Stärke dieser Signale wird jedoch durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst: Alter und Status des Tieres, Leitfähigkeit der Elektrode, Platzierung der Elektrode in der Nähe bestimmter ORNs, Platzierung des Bodens und andere Faktoren. Um etwaige zwischenindividuelle Unterschiede in den Reaktionsgrößen zu kontrollieren, wurde die Reaktion jeder Biene zunächst auf jede IAA-Konzentration allein (0, 10–3, 10–1) normalisiert und dann die Durchschnittswerte für alle Bienen berechnet und die statistischen Analysen wurden für wiederholte Messungen der EAG-Reaktionen durchgeführt (Friedman-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichen). Um die statistischen Unterschiede zwischen den normalisierten Mittelwerten hervorzuheben, zeigen wir zusätzlich die Rohdaten für jede Biene in der ergänzenden Abbildung 1.

Reaktionen von olfaktorischen Rezeptorneuronen. (a) Beispiel für EAG-Reaktionskurven von einer einzelnen Biene auf alle Gerüche und Kombinationen. Die schwarze Linie unter der Aufzeichnung zeigt das Vorhandensein des Reizes an (2 s). (b) Mittelwert der normalisierten Antwortamplitude (± SEM) auf verschiedene Konzentrationen von Geosmin. (c) Mittelwert der normalisierten Antwortamplitude (± SEM) auf verschiedene Konzentrationen von Geosmin in Kombination mit IAA 10–3. (d) Mittelwert der normalisierten Antwortamplitude (± SEM) auf verschiedene Konzentrationen von Geosmin in Kombination mit IAA 10–1. IAA 10-x: Isoamylacetat 10-x (Vol./Vol.); Geo 10-x: Geosmin 10-x (Vol./Vol.); Die Statistiken stammen aus einem Friedman-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichen mit Kontrolle, IAA3 und IAA1, jeweils in B, C, D: ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05. Die individuellen Amplitudenantworten aller getesteten Bienen (n = 24) sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Die Ergebnisse zeigten eine Reaktion, die sich bei einer Geosminkonzentration von 10–4 oder höher deutlich von der Mineralölkontrolle unterschied. Die Signale folgten dem typischen exponentiellen Amplitudenanstieg als Reaktion auf steigende Konzentrationen (Abb. 2b, ergänzende Abb. 1d). Die Reaktionen auf die niedrigsten Geosminkonzentrationen (10–5 und 10–6) unterschieden sich nicht signifikant von der Kontrolle, wahrscheinlich weil die Signaldifferenz unter der Auflösungsgrenze dieser Methode lag. Bei einer Geosminkonzentration von 10–5 ist jedoch in den meisten Fällen ein deutlicher Trend zur Erhöhung der Amplitude zu beobachten (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 1a, d).

Die Stimulation mit IAA in einer Konzentration von 10–3 löste eine starke Reaktion aus (Abb. 2a), die in Gegenwart von Geosmin 10–6 verringert zu sein schien, obwohl der Effekt nicht signifikant ist (Abb. 2c, ergänzende Abb. 1b, e). . Bei Geosmin in Konzentrationen von 10–4 oder höher waren die Signale als Reaktion auf Mischungen im Vergleich zur reinen IAA-Stimulation signifikant erhöht (Abb. 2c, ergänzende Abb. 1b, e). Wenn die Antennen Mischungen mit IAA in einer Konzentration von 10–1 ausgesetzt wurden, zeigten die Signale eine Verringerung, wenn eine Geosmin-Konzentration von 10–5 vorlag, und in diesem Fall war der Unterschied in Bezug auf IAA signifikant (p = 0,01, Abb. 2d, ergänzende Abb. 1c,f). Dieser Unterschied lässt sich besser in der ergänzenden Abbildung 1c erkennen, in der die einzelnen Antworten dargestellt sind. Hier zeigen 75 % der Bienen (18 von 24) eine verringerte Reaktion in Gegenwart von Geosmin bei einer Konzentration von 10–5 im Vergleich zu reinem IAA bei einer Konzentration von 10–1 (Individuen dargestellt durch blaue Linien).

Die Ergebnisse zeigten, dass für die verhaltensgetestete IAA-Konzentration (10–1) die Reaktionsamplituden auf Mischungen niedriger waren als die Summe der Reaktionen auf die einzelnen Verbindungen (grüne gestrichelte Linien in der ergänzenden Abbildung 1f). Bei einer Geosmin-Konzentration von 10–5 sehen wir, dass sich diese Unterdrückung in einer deutlichen Verringerung der Reaktion im Vergleich zu reinem IAA widerspiegelt. Für die verhaltensgetestete Konzentration von Geosmin war der Unterschied jedoch nicht signifikant. Dies könnte zum Teil auf die durch die Methode vorgegebene Nachweisschwelle zurückzuführen sein, d. h. die Stimulation mit Geosmin allein in den niedrigsten Konzentrationen löste kein nachweisbares Reaktionssignal aus (Abb. 2b), und das Gleiche gilt auch für die Kombination mit IAA 10–1 (verhaltensgetestete Konzentration) hatte Geosmin 10–6 keinen signifikanten Effekt (Abb. 2d). Darüber hinaus stimmt der beobachtete Effekt einer Geosminkonzentration von 10–5 im EAG mit dem Effekt überein, der für eine Geosminkonzentration von 10–6 in den Verhaltensreaktionen beobachtet wurde, was auf eine mögliche Korrelation der ORN-Reaktionen mit dem beobachteten Phänomen auf Verhaltensebene hindeutet. Wenn die Verhaltenseffekte jedoch bereits auf der Rezeptorebene verursacht wurden, sollte sich diese Interaktion auch bei der Signalübertragung bis zum Antennenlappen manifestieren.

Um die geruchsinduzierte Aktivität über die nächste Verarbeitungsebene hinweg zu verfolgen, führten wir eine Kalzium-Bildgebung der Projektionsneuronen in den Antennenlappen der Honigbiene durch. Diese Neuronen übermitteln Informationen von den ALs an Gehirnzentren höherer Ordnung. Bildgebende Experimente wurden an 14 Bienen durchgeführt, die denselben Gerüchen in denselben Konzentrationen ausgesetzt waren wie im Verhaltenstest. Die durch den Geruchsreiz induzierte Änderung der Fluoreszenz wurde in 19 Glomeruli aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2). Im Durchschnitt über den 3-s-Stimuluszeitraum zeigten diese glomerulären Signale bei den Bienen stark stereotype Reaktionsmuster (Abb. 3c zeigt als Beispiel die IAA-Geosminmischung).

Glomeruläre Reaktionen. (a) Mittlere glomeruläre Reaktionskurven auf reines Geosmin in zwei verschiedenen Konzentrationen, 10–6 und 10–3, und auf drei blumige Duftstoffe; 1-Nonanol, Acetophenon und 3-Hexanol in einer Konzentration von 5∙10–3 für 19 Glomeruli (ergänzende Abbildung 2a), gemittelt über alle identifizierten Glomeruli bei 14 Bienen. Die Geruchsstimulation begann nach 3 s und dauerte 3 s, markiert durch gestrichelte weiße Linien. Farblich markiert ist die kalziuminduzierte Fluoreszenzänderung in Prozent. Unterschiede zwischen den Reaktionen auf Geosmin 10–6 und 10–3 waren für Glomerulus 19 (t(2) = -12,1, p = 0,013) und Glomerulus 36 (t(13) = -2,2, p = 0,047) signifikant (b) Mittlere glomeruläre Reaktionskurven auf die Alarmpheromonverbindung Isoamylacetat (IAA) bei einer Konzentration von 10–1 und auf Mischungen von IAA mit den beiden Konzentrationen von Geosmin. Aufgrund der stärkeren Reaktionen auf 10–1 IAA ist die Farbskala unterschiedlich. Unterschiede zwischen den Reaktionen auf reines IAA und auf IAA + Geosmin 10–6 sind für Glomerulus 49 (t(13) = -2,6, p = 0,043) und Glomerulus 52 (t(6) = -3,3, p = 0,02) signifikant IAA und IAA + Geosmin 10–3 für Glomerulus 43 (t(6) = -3,3, p = 0,02) und zwischen IAA + Geosmin 10–6 und IAA + Geosmin 10–3 für Glomerulus 52 (t(6) = 3,2). , p = 0,028). (c) Zeitgemittelte glomeruläre Reaktionsamplituden auf die Mischung aus IAA und 10–6 Geosmin in jeder Biene, die die Stereotypie der Reaktion zeigen. Grau stellt Fälle dar, in denen Glomeruli nicht eindeutig identifiziert werden konnten.

Die durchschnittlichen zeitlichen Reaktionskurven zeigen die sehr unterschiedlichen Reaktionen auf vier reine Düfte (Abb. 3a): Geosmin in den gleichen beiden Konzentrationen wie in den Verhaltenstests, 10–6 und 10–3 in Mineralöl, und die drei Blumendüfte 1 -Nonanol, Acetophenon und 3-Hexanol, alle in einer Konzentration von 5∙10–3 in Mineralöl. Geosmin löst in einer Konzentration von 10–6 Reaktionen in verschiedenen Glomeruli aus, das Spektrum erweist sich als breiter als das des Blumendufts. Es zeigt tonische erregende Reaktionen in 3 Glomeruli (19, 28, 36), phasische erregende Reaktionen in anderen 4 (25, 29, 35, 49) und Hemmung in mindestens 3 Glomeruli (42, 48, 60), während die blumigen Gerüche lösen vergleichbare Reaktionen nur in bis zu 4 Glomeruli aus. Überraschenderweise verschwinden die Reaktionen auf Geosmin bei der 1000-fach höheren Konzentration von 10–3 fast vollständig, was auf eine nichtmonotone Konzentrationsabhängigkeit im Reaktionsmuster des Projektionsneurons (PN) schließen lässt. Unterschiede zwischen Geosmin 10–6 und 10–3 sind für Glomerulus 19 (t(2) = − 12,1, p = 0,013) und Glomerulus 36 (t(13) = − 2,2, p = 0,047) signifikant. Die Mittelwerte deuten auf einen Unterschied auch im Glomerulus 28 hin, aber aufgrund der hohen Fluktuation zwischen den Probanden ist der Effekt nicht signifikant (t(13) = − 1,5, p = 0,17).

Anschließend wurden die Bienen erneut mit der Alarmpheromonverbindung IAA in der gleichen Konzentration wie im Verhaltensexperiment von 10–1 stimuliert, die mindestens 20-fach höher ist als die anderen Reize und dementsprechend deutlich stärkere Reaktionen hervorruft. Neben IAA wurden auch dessen Mischungen mit Geosmin getestet. Bemerkenswerterweise scheinen alle Glomeruli, die auf IAA reagieren, auch auf Geosmin zu reagieren. Auch in den Mischungen sind die Geosminbeiträge bei einer Konzentration von 10–6 deutlich sichtbar, verschwinden jedoch bei einer Konzentration von 10–3 fast vollständig. Unterschiede zwischen reinem IAA und IAA + Geosmin 10–6 sind für Glomerulus 49 (t(13) = -2,6, p = 0,043) und Glomerulus 52 (t(6) = − 3,3, p = 0,02) signifikant. Mittelwerte deuten auch auf einen Unterschied im Glomerulus 19 hin, der Glomerulus ist jedoch nur bei drei Bienen eindeutig identifiziert (Abb. 3c), sodass der Effekt nicht signifikant ist (t(2) = − 2,5, p = 0,14). Bei der Mischung IAA + Geosmin 10–3 entfallen diese Unterschiede. Die Reaktion auf diese Mischung unterscheidet sich deutlich von der Reaktion auf reines IAA für Glomerulus 43 (t(6) = − 3,3, p = 0,02). Die Reaktionen auf IAA + Geosmin 10–6 und IAA + Geosmin 10–3 unterscheiden sich signifikant für Glomerulus 52 (t(6) = 3,2, p = 0,028).

Eine signifikante Wechselwirkung zwischen Geosmin und IAA war nicht nachweisbar und die Reaktionen auf die Mischung scheinen genau die Summe der Reaktionen der einzelnen Verbindungen zu sein. Daher konnten wir die Wechselwirkung zwischen den beiden Gerüchen auf der Ebene der Antennen oder im AL nicht direkt bestätigen. Allerdings konnten wir solche Wechselwirkungen auch nicht ausschließen, da nur 12 % aller Glomeruli optisch zugänglich waren. Betrachtet man nur die gemessenen PN-Signale, deuten die bisherigen Erkenntnisse darauf hin, dass Wechselwirkungen zwischen IAA und Geosmin nur in höherstufigen Gehirnzentren wie dem Pilzkörper (MB) oder dem Seitenhorn (LH) auftreten.

Während bekannt ist, dass die Reaktionen von PNs als Funktion der Zeit komplex und nicht monoton sind und die Reaktion einzelner PNs als Funktion der Konzentration sowohl steigen als auch fallen kann22, erscheint es ungewöhnlich, dass es insgesamt zu phasischen Reaktionen auf Geosmin kommt Die beobachteten Glomeruli scheinen bei höheren Konzentrationen abzunehmen und verschwinden bei einer Konzentration von 10–3 praktisch. Wir haben ein rechnergestütztes Spiking-Neuronales-Netzwerk-Modell des frühen Geruchssystems von Bienen erstellt, um zu untersuchen, ob diese und unsere anderen Beobachtungen mit unserem aktuellen Verständnis des Systems übereinstimmen. Das Modell baut auf früheren Arbeiten23,24 auf und beschreibt Geruchsrezeptoren mit einem zweistufigen Bindungs- und Aktivierungsprozess25. Riechrezeptoren erregen dann Riechrezeptorneuronen (ORN), die wiederum Projektionsneuronen (PNs) und lokale Neuronen (LNs) im Antennenlappen erregen. Alle ORNs mit demselben Rezeptortyp projizieren auf denselben Glomerulus26. LNs hemmen PNs und LNs in allen anderen Glomeruli. Die Schaltung ist in Abb. 4a dargestellt. Das Modell verfügt über 160 Rezeptortypen und damit Glomeruli sowie 5 PNs und 25 LNs pro Glomerulus, was den derzeit besten Schätzungen entspricht. Wir haben 60 ORNs jedes Typs simuliert, was bedeutet, dass jedes simulierte ORN in der Realität etwa 10 ORNs darstellt. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Methoden. Abbildung 4c zeigt eine beispielhafte Datenspur aus den Simulationen. Gerüche wurden als stufenweise Änderung von Null auf eine konstante Konzentration für 3 s (grauer Balken) eingeführt und dann auf 0 zurückgesetzt. Die OR-Aktivierung beginnt unmittelbar nach Einsetzen des Geruchs und führt dann zu einem Anstieg der ORNs, gefolgt von PN und mit kaum merklicher Verzögerung LN-Spitzen. Im Beispiel ORN und LN kann man einen Hinweis auf die Anpassung der Spitzenrate erkennen, diese wird jedoch bei höheren Spitzenraten deutlicher. PNs verfügen in diesem Modell nicht über eine Spike-Rate-Anpassung.

Computermodell. (a) Schaltplan des Modells. ORNs regen PNs und LNs im AL entsprechend ihrem Rezeptortyp (Farben) an. LNs werden auch von den PNs innerhalb desselben Glomerulus erregt. LNs hemmen PNs und LNs in allen anderen Glomeruli, jedoch nicht in ihren eigenen. (b) Reaktion der ORNs auf verschiedene Mischungen der Gerüche „IAA“ und „Geosmin“. (c) Beispieldaten für eine typische Geruchsreaktion. Der Balken im oberen Feld zeigt die Geruchsbelastung an. Für ORNs, PNs und LNs wird die Spur eines beliebigen Beispielneurons angezeigt, das mit dem am stärksten reagierenden Glomerulus verbunden ist. Zur Verdeutlichung wurden den Potenzialspuren der LIF-Membran Spitzen als vertikale Linien hinzugefügt. (d) Zeitgemittelte Reaktionen der PNs (Spike Density Function SDF) im am stärksten reagierenden Glomerulus als Reaktion auf 100 verschiedene simulierte Gerüche, die jeweils 3 s lang und in unterschiedlichen Konzentrationen präsentiert wurden. (e) Wärmekarten, die die mittlere PN-Aktivität in jedem der Glomeruli als Reaktion auf „Geosmin“, „IAA“ und Mischungen der beiden Gerüche veranschaulichen.

Durch die Untersuchung der EAG-Aufzeichnungen und PN-Bildgebungsergebnisse stellten wir die Hypothese auf, dass die ungewöhnlich abnehmenden Reaktionen in allen beobachteten Glomeruli bei höheren Konzentrationen von Geosmin auf die lokale Hemmung zurückzuführen sein könnten, die durch LNs im AL vermittelt wird. Darüber hinaus wurde nicht häufig über nicht-monotones Verhalten berichtet, weshalb wir zu dem Schluss kamen, dass Geosmin eine besondere Eigenschaft haben muss, die es anfällig für übermäßige Hemmung macht. Wir haben die Eigenschaften von Geruchsreaktionen untersucht, einschließlich der Empfindlichkeit (η im OR-Modell), der Breite der Reaktion über Rezeptortypen hinweg (σ im OR-Modell) und der Aktivierung (k2 im OR-Modell). Wir fanden heraus, dass die Breite der Reaktion der entscheidende Faktor war, der zu nicht-monotonen Beziehungen zwischen Reaktion und Konzentration im PN führte. Abbildung 4d veranschaulicht dieses Ergebnis. Wir haben 98 Gerüche mit einer zufälligen Verteilung der Reaktionseigenschaften und zwei mit spezifischeren Gerüchen erzeugt, einen Geruch mit einem sehr breiten Reaktionsprofil, den wir mit Geosmin identifizieren, und einen Geruch mit einem durchschnittlichen Breitenprofil, aber einer sehr hohen Aktivierung, die wir identifizieren mit IAA. Wie in Abb. 4d zu sehen ist, zeigt „Geosmin“ eine nichtmonotone Reaktion als Funktion der Konzentration, während „IAA“ im Wesentlichen monoton ist. Die zufällig ausgewählten anderen Gerüche unterscheiden sich in ihrem Verhalten, weisen jedoch in der Mehrzahl typische, ansteigende Sigmoid-Reaktionskurven auf. Wir fanden heraus, dass die Monotonie (eine formale Definition finden Sie unter „Methoden“) oder deren Fehlen von Geruchsreaktionen stark mit der Breite des Geruchsprofils korreliert (Ergänzende Abbildungen 3, 4, 5, 6). Die Intuition hinter dem nichtmonotonen Verhalten von Gerüchen mit ungewöhnlich breiten Reaktionen besteht darin, dass mit zunehmender Konzentration mehr OR-Typen aktiviert werden, wodurch sich die Anzahl der beteiligten Glomeruli und damit die globale Hemmung erhöht, zusätzlich zu der Zunahme der Hemmung aufgrund der erhöhten Aktivierung von OR Typen, die bereits aktiv sind. Gleichzeitig nimmt die Erregung jedes Glomerulus nur entsprechend der Sigmoid-Reaktionskurve des entsprechenden OR-Typs zu. Wenn das Reaktionsprofil breit ist, kann der kombinierte Anstieg der Hemmung den Anstieg der Erregung überwiegen und die gesamte PN-Reaktion nimmt ab. Bei engeren Reaktionsprofilen ist die übermäßige Hemmung durch neu rekrutierte OR-Typen geringer und die PN-Reaktion nimmt weiter zu.

Wir haben dann gefragt, ob wir die beobachteten Wechselwirkungen von Geosmin und IAA, die in den EAG-Daten zu sehen sind, auch reproduzieren können (Abb. 2). Hier haben wir die Gesamtzahl der ORN-Spitzen über alle OR-Typen hinweg als sinnvollen Indikator für eine EAG-Messung interpretiert und daraus geschlossen, dass Wechselwirkungen wahrscheinlich auf syntopische Mischungseffekte an den Rezeptoren zurückzuführen sind. Vor diesem Hintergrund würde Geosmin zu einer Hemmung der IAA-Antworten auf der Antenne führen, wenn seine Aktivierung geringer wäre als die der IAA. Wir haben daher die Aktivierungsrate k2 von „Geosmin“ niedriger als die von „IAA“ eingestellt und ORN-Spike-Zählungen für Mischungen aus „Geosmin“ und „IAA“ generiert. Durch manuelle Untersuchung haben wir herausgefunden, dass die Reaktionen bei einer Beziehung von ungefähr 1:3 (k2Geo = 0,03 kHz, k2IAA = 0,1 kHz) Unterdrückungseffekte aufwiesen, die Gemeinsamkeiten mit den experimentellen Beobachtungen zeigten (Abb. 2b–d, 4b). Der genaue quantitative Zusammenhang bei verschiedenen Konzentrationsverhältnissen hängt neben dem k2-Verhältnis auch von der Überlappung der OR-Aktivierungsprofile „Geosmin“ und „IAA“ ab. Wir haben dies getestet, indem wir „Geosmin“ und „IAA“ als Gaußsche Antwortprofile mit einem bestimmten Abstand zwischen ihren Maxima generiert haben. Bei kleinen Entfernungen (große Überlappung) dominiert die syntopische Unterdrückung von IAA-Antworten, und bei großen Entfernungen (kleine Überlappung) sind die Reaktionen additiver (ergänzende Abbildung 7). Während das Modell im Prinzip die Unterdrückung von IAA-Reaktionen durch Geosmin reproduziert, konnten wir die mehr oder weniger konstanten Reaktionen in Abb. 2d mit diesem Schema nicht vollständig reproduzieren, ohne die Übereinstimmung von Modellverhalten und Experimenten auf der Ebene der zu verlieren AL (siehe oben). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die experimentellen Beobachtungen mit anderen Methoden zur Generierung überlappender Antwortprofile oder sogar mit anderen als Gaußschen Antwortprofilen genauer reproduziert werden könnten.

Schließlich fragten wir, ob die „Geosmin“- und „IAA“-Gerüche, die erzeugt werden, um das nichtmonotone Verhalten in PNs und die subadditiven Antworteigenschaften in der EAG zu reproduzieren, PN-Reaktionen hervorrufen würden, die den Calcium-Bildgebungsdaten der PN-Aktivität in ähneln die AL. Abbildung 4e zeigt die simulierten Reaktionsmuster der PNs als Reaktion auf Geosmin bei 10–6, 10–3 (vergleiche Abb. 3a), IAA bei 10–1 und die Mischungen aus IAA bei 10–1 und Geosmin bei 10–6 und 10–3 (vergleiche Abb. 3b). Insgesamt ähneln die Reaktionen den experimentellen Daten mit einer mäßigen Reaktion auf „Geosmin“ 10–6, die bei 10–3 im Wesentlichen verschwindet. In den Mischungen hat die Zugabe von „Geosmin“ 10–6 zu IAA 10–1 fast keine sichtbaren Auswirkungen, während die Zugabe von „Geosmin“ 10–3 das Reaktionsprofil etwas zu schärfen scheint, wobei Glomeruli durch „IAA“ und „Geosmin“ stark aktiviert werden noch stärker aktivierte und schwach aktivierte Glomeruli sind leicht deprimiert, vermutlich aufgrund einer zusätzlichen globalen Hemmung durch die LNs. Bei der visuellen Untersuchung scheinen in den experimentellen Daten ähnliche Effekte vorhanden zu sein (Abb. 3b), wir haben jedoch keine statistisch signifikanten Effekte identifiziert.

Während die Verteidigung des Bienenvolkes für Honigbienen von entscheidender Bedeutung ist, ist sie auch sehr kostspielig. Ihr mit Widerhaken versehener Stachel bleibt in elastischen Materialien eingebettet und reißt beim Abzug der Biene vom Hinterleib ab. Daher sollte die Entscheidung, auf das Alarmpheromon mit einem Stich zu reagieren, streng geregelt werden, um unnötige Verluste in der Belegschaft zu vermeiden. Es gibt mehrere Beweise dafür, dass dies tatsächlich der Fall ist: Die Reaktionsfähigkeit von Alarmpheromonen nimmt ab, wenn die Konzentration zu hoch ist27, wenn die Gruppengröße zunimmt28 und wenn appetitanregende Verbindungen vorhanden sind19. Diese zusätzlichen Hinweise können Bienen darauf hinweisen, dass die Bedrohung bereits behoben wird oder dass dies nicht der richtige Kontext für eine Abwehrreaktion ist. Hier berichten wir über einen weiteren Fall einer solchen Unterdrückung der Alarmpheromonreaktion, die durch die Anwesenheit von Geosmin hervorgerufen wird (Abb. 1). Interessanterweise haben wir die Bienen mit zwei Geosmin-Konzentrationen getestet und diese hemmende Wirkung nur bei Verwendung der niedrigsten Konzentration festgestellt. Über konzentrationsabhängige Auswirkungen von Gerüchen auf das Verhalten wurde bereits berichtet, dass Weberameisen beispielsweise eine Reihe von Verhaltensweisen zeigen, wenn sie sich einer Quelle nähern (und somit einen Konzentrationsanstieg wahrnehmen), die 1-Hexanol freisetzt, einen Bestandteil ihres eigenen Alarmpheromons29. Kürzlich wurde über nichtmonotone Verhaltensreaktionen auf IAA selbst bei Honigbienen berichtet27. Genauer gesagt stieg die Stechhäufigkeit einzelner Bienen, die im gleichen Verhaltenstest getestet wurden, mit der IAA-Konzentration auf bis zu 2,5∙10–1, sank dann aber wieder ab, wenn höhere Konzentrationen verwendet wurden. Zusätzlich zu der starken Überlappung, die zwischen den durch Geosmin und IAA aktivierten Glomeruli beobachtet wurde, könnte eine Hypothese sein, dass die additive Aktivierung durch Geosmin die Verhaltensreaktion in Richtung des abnehmenden Bereichs dieser IAA-Dosis-Wirkungs-Kurve verschieben würde. Obwohl diese Hypothese noch weiter getestet werden muss, halten wir sie für unwahrscheinlich, da die Abnahme des Stechverhaltens nur bei sehr hohen IAA-Konzentrationen auftritt, was vermutlich viel stärkere Aktivierungen als die hier aufgezeichneten erfordert.

Eine ähnliche Modulation des Abwehrverhaltens, bei der die stechende Reaktion auf das Alarmpheromon durch die Hinzufügung eines anderen Geruchs verringert wurde, wurde bereits zuvor beobachtet19. Dieser Effekt war spezifisch für Blütenverbindungen mit appetitanregendem Wert. Signalisiert Geosmin Nahrung für Honigbienen? Diese Hypothese könnte überprüft werden, indem in einer zukünftigen Studie die Häufigkeit der spontanen Verlängerung des Rüssels als Reaktion auf diese Verbindung gemessen wird19. Streptomyces-Bakterien wurden in Blüten gefunden und können Honigbienen vor Krankheitserregern schützen30. Während die überwiegende Mehrheit der Streptomyces-Arten Geosmin produzieren kann31, wurde über den tatsächlichen Nachweis von Geosmin im Blumenstrauß jedoch nur bei wenigen Kakteenarten32 berichtet. Ob diese Verbindung Bienen zu Blüten locken und somit direkt an der Vermittlung gegenseitiger Interaktionen beteiligt sein könnte, muss daher noch überprüft werden. Eine weitere spannende Möglichkeit wäre, dass Geosmin, obwohl es nicht speziell in Blumen vorkommt, einen allgemeinen Anstieg der Nektarverfügbarkeit signalisiert: Tatsächlich steigt die Nektarproduktion nach Regen33, wenn Geosmin auch von Bodenbakterien freigesetzt wird. Das Vorhandensein von Geosmin könnte daher bei Honigbienen Futtersuchreaktionen auslösen, genau wie appetitliche Blütenverbindungen.

Geosmin ist eine ökologisch relevante Verbindung, die bei einer Reihe von Arthropodenarten, darunter Fliegen7,8, Mücken5 und Springschwänzen34, entweder Anziehung oder Abstoßung hervorruft. Obwohl seine ökologische Funktion im Fall von Honigbienen noch immer rätselhaft ist, deuten unsere Daten darauf hin, dass sie für diesen wichtigen Bestäuber ebenso relevant sein könnte und eine weitere Untersuchung wert ist.

Die Ergebnisse der Elektroantennographie legen nahe, dass die nichtmonotone Konzentrationsabhängigkeit des Verhaltens nicht auf eine anomale Empfindlichkeit der Rezeptoren gegenüber Geosmin zurückzuführen ist, da die EAG-Amplitude eine typische ansteigende Dosis-Wirkungs-Kurve für Reize mit reinem Geruch zeigt (Abb. 2b). Da ein Verhaltenseffekt jedoch nur bei Mischungen zwischen Geosmin und IAA beobachtet wurde, sind mögliche Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Reizen am interessantesten. Tatsächlich zeigt die Reaktionsamplitude auf die binäre Mischung im Vergleich zu einer erwarteten linearen Summe der reinen Geruchsreaktionsamplituden35 nicht diesen deutlichen Anstieg mit der Konzentration. Die Mischung aus Geosmin mit einer niedrigen IAA-Konzentration zeigt eine Tendenz zu einem geringeren Signalanstieg mit zunehmender Geosmin-Konzentration (Abb. 2c). Für die hohe IAA-Konzentration (Abb. 2d) wird der Effekt signifikant: Die Zugabe von Geosmin 10–5 führt zu einer deutlichen Abnahme des Signals, und der erwartete signifikante Anstieg ist erst bei einer Geosmin-Konzentration von 10–3 zu beobachten. Dosis-Wirkungs-Kurven, bei denen eine höhere Konzentration nicht unbedingt zu einer Erhöhung der Reaktionsamplitude führt, wurden bereits früher bei EAG-Messungen bei Honigbienen beobachtet, und dabei handelte es sich auch um Reaktionen auf Geruchsmischungen36.

Eine Wechselwirkung von Geosmin und IAA steht im Einklang mit dem Verhaltenssignal, bei dem die Wirkung von Geosmin auf das IAA-induzierte Stechen für Geosmin 10–6 signifikant war, für Geosmin 10–3 jedoch verschwand.

Der dieser Wechselwirkung zugrunde liegende Mechanismus könnte die Maskierung von IAA durch Geosmin auf der Ebene der Rezeptoren sein, ein Effekt, über den berichtet wurde37. Interessanterweise wurde in dieser Arbeit IAA als starkes Maskierungsmittel identifiziert, es wurde jedoch auch gezeigt, dass es durch einige Gerüche überdeckt werden kann37. Eine Voraussetzung für die Maskierung ist die Empfindlichkeit der Rezeptoren gegenüber beiden Gerüchen. Das EAG-Signal ist die Summe der Aktivität in einem großen Teil der 60.000 ORNs und erlaubt keine eindeutige Identifizierung von Maskierungsmechanismen, die auf einen kleinen Teil der ORNs beschränkt sind. Um weitere Einblicke in mögliche Wechselwirkungen zu gewinnen, führten wir eine Kalzium-Bildgebung der Geruchsreaktionen auf der Ebene des Antennenlappens durch.

Eine Voraussetzung für eine Interaktion zwischen beiden Gerüchen wurde durch die Antwortkarten der glomerulären Projektionsneuronen bestätigt. Obwohl bei verschiedenen Probanden nur eine Untergruppe von 19 von 160 Glomeruli (ergänzende Abbildung 1) konsistent identifiziert werden konnte, wurde festgestellt, dass alle durch IAA aktivierten Glomeruli auch durch Geosmin 10–6 aktiviert wurden (Abb. 3).

Ein weiterer überraschender Befund der Kalziumbildgebung war eine nichtmonotone Abhängigkeit der Projektionsneuronenreaktionen von der Geosminkonzentration (Abb. 3a, b). Unter Verwendung der gleichen Konzentrationen wie in den Verhaltensstudien verschwanden die breiten und starken Reaktionen auf Geosmin 10–6 für 10–3 fast vollständig. Dies steht wiederum im Einklang mit den Verhaltensdaten. Allerdings scheint eine solche nichtmonotone Konzentrationsabhängigkeit sehr selten vorzukommen. Auf der Ebene des Antennenlappens wurde es bei Bienen bisher nicht beobachtet. Eine Arbeit an Motten zeigt solche Reaktionen auf Pheromonkomponenten aus elektrophysiologischen Aufzeichnungen in der AL, die Art der Neuronen bleibt jedoch unbestimmt38. Auf der Ebene des Körpereintrags von Honigbienenpilzen zeigten PN-Boutons stark unterschiedliche Konzentrationsabhängigkeiten39, monotone Zu- und Abnahmen sowie nichtmonotone Veränderungen. Die Autoren schlugen eine Hemmung auf der Ebene der Boutons vor. Eine andere Arbeit an Motten ergab nur monotone Anstiege auf der Ebene der AL in den PN-Dendriten, aber auf der Ebene der PN-Somata auch nichtmonotone Reaktionen40. Der vermutete zugrunde liegende Mechanismus war eine postsynaptische Hemmung. Zusätzlich zu den beiden Positionen, an denen die Hemmung eine solche Änderung der Konzentrationsabhängigkeit hervorrufen könnte, deuten unsere Daten nun darauf hin, dass auch die Hemmung innerhalb des Antennenlappens einen Effekt haben könnte.

Die Abbildung der Reaktion auf Mischungen aus IAA und Geosmin bestätigte die nichtmonotone Abhängigkeit von der Geosminkonzentration auch unter dieser Bedingung. Eine Wechselwirkung von IAA und Geosmin wurde jedoch in der abgebildeten Untergruppe der Glomeruli nicht beobachtet; die Mischungen lösten eine Reaktion aus, die die exakte Summe der reinen Geruchsreaktionen beider Verbindungen zu sein scheint (Abb. 3b). Dies deutet auf zwei mögliche Szenarien hin: Entweder variieren die Interaktionen zwischen den Glomeruli und sind in der Teilmenge, die wir abbilden konnten, nicht sichtbar, oder unsere Beobachtungen des EAG-Signals sind nicht auf eine Interaktion von ORNs zurückzuführen, und es finden auch keine Interaktionen auf der Ebene der Glomeruli statt Antennenlappen, wo Gerüche identifiziert werden, sondern eher in den höheren Gehirnzentren wie dem Pilzkörper und dem Seitenhorn, wo die Wertigkeit der Gerüche extrahiert wird41.

Ein letztes wichtiges Ergebnis der Calcium-Bildgebung ist die Beobachtung einer breiten Reaktionskarte, die Geosmin hervorruft, was eine kombinatorische Kodierung dieses Geruchs beweist, im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Fruchtfliegen8 und Mücken10, bei denen die Reaktion auf einen einzelnen Glomerulus beschränkt war, was entspricht der komplementäre Kodierungsmechanismus einer markierten Linie42. Studien zur Entwicklung von Geruchsrezeptoren legen tatsächlich nahe, dass es wahrscheinlich Unterschiede in den Kodierungsmodi zwischen den Arten gibt43. Die Breite des Spektrums der von Geosmin aktivierten Rezeptoren scheint tatsächlich breiter zu sein als die der im Vergleich abgebildeten Blumendüfte (Abb. 3a). Diese Beobachtung erwies sich als entscheidend für den folgenden Versuch, zu untersuchen, wie die umgekehrte Konzentrationsabhängigkeit aus der Verarbeitung der regulären Eingangssignale im Antennenkeulennetzwerk entstehen könnte.

Die rätselhaften Ergebnisse einer umgekehrten Konzentrationsabhängigkeit der Geosmin-Reaktion in den Output-Neuronen des Antennenlappens sowie der Interaktion zwischen Geosmin und IAA auf der Ebene der olfaktorischen Rezeptorneuronen wurden mit Hilfe eines Computermodells des olfaktorischen Rezeptors kontextualisiert Neuronen und die AL. Wir haben gezeigt, dass ein solches Reaktionsmuster als Ergebnis der spezifischen Eigenschaften der Rezeptorreaktionen und eines spezifischen Gleichgewichts der erregend-hemmenden Kopplung im AL entstehen kann. Das Fortbestehen einiger schwacher phasischer Reaktionen bei der höheren Geosminkonzentration legt nahe, dass eher eine Hemmung als ein Verschwinden des Erregungsantriebs für die Signaländerung verantwortlich ist. Dies wird durch das Modell reproduziert, in dem schwache phasische Reaktionen bei höheren Konzentrationen bestehen bleiben, da die Hemmung von PNs durch lokale Interneurone immer etwas später erfolgt als die direkte Erregung durch sensorische Neuronen. Die nahezu verschwindende Geosmin-Reaktion bei höheren Konzentrationen mag auf den ersten Blick überraschend sein, da andere Geruchsstoffe gleichzeitig völlig normale Reaktionsprofile mit zunehmenden oder sättigenden Reaktionen bei zunehmender Konzentration aufweisen und das Muster hemmender Verbindungen natürlich eine Schaltkreiseigenschaft ist, unabhängig davon Geruch. Mit unserem Rechenmodell haben wir gezeigt, dass derselbe Hemmkreislauf entgegen intuitiver Erwartungen zu qualitativ unterschiedlichem Reaktionsverhalten führen kann, basierend auf der Breite, Empfindlichkeit und Aktivierung des ORN-Ensembles als Reaktion auf verschiedene Geruchsstoffe. Wie in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 3, 4, 5: Abhängig von der Breite der Aktivierung im gesamten Rezeptorreservoir können PN-Reaktionsprofile als Funktion steigender Konzentration von monoton zunehmend zu zunehmend/abfallend und im Extremfall verschwindend wechseln. Dieses Ergebnis und die beobachtete ungewöhnliche Konzentrationsabstimmung der Geosmin-Reaktion legen nahe, dass die Geosmin-Reaktionen bei Bienen im Gegensatz zu anderen Insekten tatsächlich breiter sind als bei anderen Gerüchen.

Die Literatur legt nahe, dass Geruchsinteraktionen auf verschiedenen Ebenen des olfaktorischen Systems auftreten. Auf der Rezeptorebene können Duftstoffe hemmende Reaktionen hervorrufen. In Kombination mit einer erregenden Komponente wurde eine Unterdrückung der letzteren beobachtet37. Dadurch verändert sich nicht nur die Amplitude der ORN-Reaktion, sondern auch die Reaktionsdynamik, was sich wahrscheinlich nicht nur auf die Wahrnehmung der Geruchsintensität, sondern auch auf die Wahrnehmung der Geruchsidentität auswirkt44. Diese Effekte sind spezifisch für einzelne Rezeptoren und würden sich in einem EAG-Signal als eine kleine Verringerung der summierten neuronalen Reaktion auf eine Mischung im Vergleich zur Summe der Reaktionen auf die einzelnen Komponenten zeigen, wie in unseren Experimenten beobachtet.

Auf der Ebene der Projektionsneuronen wird häufig der Effekt der Mischungsunterdrückung beobachtet, dh die glomeruläre Reaktion auf eine Mischung ist geringer als die auf ihre stärkste Komponente45. Bei Honigbienen wurde festgestellt, dass die beiden unterschiedlichen AL-Wege unterschiedlich auf Geruchsmischungen reagieren. Während die Projektionsneuronen des medialen Trakts (m-PNs) von der wirksamsten Verbindung dominiert wurden, zeigten die Projektionsneuronen des lateralen Trakts (l-PNs), die in unseren Experimenten abgebildet wurden, häufig unterdrückte Reaktionen auf Mischungen46. Die Rolle des lokalen inhibitorischen Interneurons bei dieser Interaktion wurde bei Drosophila durch die Verabreichung von Picrotoxin, einem Antagonisten von GABAA-ähnlichen Rezeptoren, gezeigt, der die Mischungsunterdrückung auf PN-Ebene beseitigte47. Computermodelle bestätigten, dass die Überschattung und Blockierung einer Geruchsreaktion durch eine andere wahrscheinlich auf eine laterale Hemmung bei der Honigbiene AL48 zurückzuführen ist. Simulationen deuten auch darauf hin, dass Mischungen eine schnellere und zuverlässigere olfaktorische Kodierung ermöglichen, was einer der Gründe sein könnte, warum Tiere bei der chemischen Signalübertragung häufig Mischungen verwenden24.

Bei Motten wurden auch komplementäre Effekte beobachtet. Eine bioaktive Mischung aktivierte stark einen zusätzlichen Glomerulus, der gegenüber den einzelnen Komponenten unempfindlich war49. Ob dieser synergetische Effekt auf der Ebene der Rezeptoren oder des AL-Netzwerks auftritt, bleibt eine offene Frage.

Andere Studien haben gezeigt, dass die Verarbeitung mischungsbezogener Informationen in der AL nicht über alle Glomeruli hinweg einheitlich ist, was eine mögliche Erklärung für den Mangel an Beweisen in unseren PN-Daten liefern könnte und darauf hindeutet, dass eine endgültige Integration der Informationen über die Mischung möglich sein könnte geschehen in Gehirnzentren höherer Ordnung50.

Die Rolle der Geruchsvalenz bei Mischungswechselwirkungen wurde bei Drosophila untersucht. Geruchsmischungen mit gegensätzlichen Wertigkeiten lösten eine starke Hemmung in auf Lockstoffe reagierenden Glomeruli aus. Die Manipulation einzelner ORNs durch Stummschaltung und optogenetische Aktivierung zeigte glomerulusspezifisches Übersprechen zwischen den auf Lockstoffe und Abwehrmittel reagierenden Schaltkreisen. Diese selektive laterale Hemmung erwies sich als entscheidend für die Verarbeitung widersprüchlicher sensorischer Informationen51.

Zusammengenommen zeichnen diese Arbeiten ein ähnliches Bild wie wir aus unseren Daten gewinnen, nämlich dass die Interaktion innerhalb von Geruchsmischungen keinen bestimmten Interaktionspunkt hat, sondern ein Effekt ist, der entlang verschiedener Verarbeitungsstufen erzeugt, verstärkt und entschlüsselt wird im Geruchssystem des Insekts.

Verhaltensexperimente zeigten, dass das durch IAA hervorgerufene Stechverhalten durch Geosmin stark reduziert wird, jedoch nur bei einer niedrigen Konzentration von 10–6, bei einer erhöhten Konzentration von 10–3 verschwindet der Effekt vollständig. Ein Test zur Interaktion zwischen beiden Gerüchen auf der Ebene der Antennen zeigt ein kompatibles Ergebnis: Wir sehen eine deutliche Verringerung des Gesamtantwortsignals auf IAA + Geo 10–5 im Vergleich zu reinem IAA, bei erhöhten Geosminkonzentrationen verschwindet der Effekt . Die Tatsache, dass der Verhaltenseffekt und die PN-Reaktionen bereits bei Geosminkonzentrationen von 10–6 erkannt werden, bei denen die Antennen keinen messbaren EAG zeigten, zeigt, wie schwierig es ist, Konzentrationen über Experimente hinweg zu vergleichen52. Konzentrationen können nur in Form von Verdünnungen der Geruchsquelle gemessen werden, da die an den Antennen ankommenden Geosminmengen weit unter der Nachweisgrenze jedes Geräts liegen. Da die Geruchsverteilung in den Versuchsaufbauten für In-vivo-Bildgebung und EAG-Messungen sehr unterschiedlich ist, werden vergleichbare Szenarien nicht durch die gleiche Verdünnung, sondern durch ähnliche Effektgrößen angezeigt. Während eine Konzentration von 10–6 Geosmin kein über dem Schwellenwert liegendes EAG-Signal hervorruft, ruft sie deutliche Reaktionen in der Kalziumbildgebung und im Kalziumverhalten hervor, was auf eine niedrigere „effektive“ Konzentration im EAG schließen lässt.

Die Calcium-Imaging-Experimente geben Aufschluss über die Geruchsreaktionen von Geosmin, IAA und den Gemischen auf der Ebene der Outputneuronen des Antennenlappens. Das überraschendste Ergebnis hierbei ist, dass auch Geosmin selbst eine verringerte Reaktion in den abgebildeten Glomeruli zeigt, wenn die Konzentration erhöht wird, was die Beobachtung verringerter Verhaltensreaktionen stützt, aber im Widerspruch zu den EAG-Ergebnissen zu stehen scheint, bei denen die ORN-Reaktionen mit der Konzentration über den beobachteten Bereich zunahmen von Konzentrationen. Das Computermodell bietet jedoch eine Erklärung, nämlich dass trotz eines monotonen Anstiegs der ORN-Reaktionen auf Geosmin eine laterale Hemmung im AL dazu führen könnte, dass das PN-Signal stark reduziert wird, wie durch Kalziumbildgebung beobachtet.

Eine Inkonsistenz bleibt jedoch bestehen: Auf der Ebene der Antennenkeule konnte keine Wechselwirkung zwischen Geosmin und IAA beobachtet werden, das Mischungssignal ist fast genau die Summe der Signale beider Komponenten. Das Vorhandensein einer solchen Interaktion wird sowohl durch die EAG als auch durch das Verhaltensexperiment nahegelegt. Allerdings schließen unsere PN-Aktivitätskarten auch die Existenz einer solchen Interaktion auf der Ebene des Antennenlappens nicht aus, da unsere Bildgebungstechnik es uns ermöglichte, 19 klar identifizierbare Glomeruli der etwa 160 im Antennenlappen einer Honigbiene vorhandenen Glomeruli aufzuzeichnen. Von diesen 19 Glomeruli reagierten nur 2 stark auf IAA. Daher ist es nicht unwahrscheinlich, dass eine Wechselwirkung in Glomeruli vorliegt, die der optischen Bildgebung nicht zugänglich sind. Da es jedoch keine direkten Belege für eine Interaktion gibt, verbleibt noch eine andere Ebene, auf der die Interaktion stattfinden könnte, nämlich in übergeordneten Gehirnzentren. Bisher hat sich die Abbildung von Reaktionsmustern im Pilzkörper53 und im Seitenhorn54 von Honigbienen als äußerst anspruchsvoll erwiesen, und die Kodierung von Geruchsmischungen wurde dort noch nie untersucht. Die jüngste Entwicklung einer transgenen Honigbienenlinie, die einen pan-neuronalen Kalziumsensor aufweist, weckt jedoch die Hoffnung, dass in Zukunft sogar eine parallele Abbildung des gesamten olfaktorischen Systems möglich sein und die Verfolgung von Mischungsinteraktionen entlang aller Verarbeitungsschritte ermöglichen würde. Bildgebende Untersuchungen an Drosophila deuten darauf hin, dass es dort durchaus zu einer Modulation eines durch das Alarmpheromon ausgelösten Verhaltens kommen kann, da in diesen Teilen des Gehirns die Kodierung der Geruchsvalenz55,56 und die Trennung von Pheromonen aus Lebensmittelgerüchen57 beobachtet wurden.

Ein weiteres Ergebnis des Calcium-Imaging-Experiments war, dass Geosmin bei Bienen im Gegensatz zu Fliegen und Mücken nicht durch eine markierte Linie kodiert wird, sondern sein Reaktionsspektrum im Gegenteil sogar größer zu sein scheint als das der getesteten Blüten- und Pheromonverbindungen. Das Rechenmodell zeigte, dass die nicht-monotone Konzentrationsabhängigkeit der Geosmin-Reaktion und ihr breites Antwortspektrum tatsächlich mit der nicht-monotonen Antwortamplitude aufgrund der lateralen Hemmung zusammenhängen könnten. Das Modell liefert tatsächlich auch eine Beispielkonfiguration, bei der das IAA-Signal in der Antenne durch die Zugabe von Geosmin aufgrund syntopischer Wechselwirkungen der Gerüche an den Rezeptoren reduziert wird. Dies gibt die detaillierten Ergebnisse aus Verhalten und EAG nicht vollständig wieder, bei denen die stärkste Unterdrückung bei niedrigen Geosminkonzentrationen beobachtet wurde. Die Gesamtreaktion des Rezeptorreservoirs auf Mischungen aus IAA und Geosmin hängt von den Details der Affinitäten aller Rezeptortypen zu beiden Gerüchen und ihrer Konzentrationsabhängigkeit ab, einschließlich syntopischer Wechselwirkungen, aber auch der Rekrutierung von mehr Rezeptoren und mehr Rezeptortypen mit zunehmender Konzentration. was durchaus für die beobachteten Unterschiede verantwortlich sein könnte.

Diese Ergebnisse stellen einen weiteren Schritt zum Verständnis der olfaktorischen Modulation des Abwehrverhaltens bei Honigbienen dar, sowohl auf Verhaltens- als auch auf neuronaler Ebene. Neben einem grundlegenden Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die zum Stechen führen, kann dies auch für die Bienenhaltung von praktischem Nutzen sein.

Jüngste Studien schlugen die Verwendung von Geosmin als natürliches Abwehrmittel gegen Schadinsekten wie D. suzukii58 vor. Vor einer Kommerzialisierung von Geosmin für diesen Zweck sollten weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen von Geosmin auf Nichtzielinsekten wie Honigbienen durchgeführt werden.

Der Kontext ist für Pheromonreaktionen von entscheidender Bedeutung. Daher sind Feldexperimente erforderlich, um die Wirkung von Geosmin vollständig zu verstehen. Dazu gehört die Überwachung des Verhaltens, insbesondere am Eingang zum Bienenstock, die Kontrolle des Alters der Bienen, ihrer Rolle im Bienenvolk und der Frage, ob sie ausfliegen oder zurückkehren.

Die Verfolgung der ausgelösten neuronalen Aktivität in die olfaktorischen Verarbeitungszentren höherer Ordnung wie das seitliche Horn und die Pilzkörper wäre ebenfalls eine wertvolle zukünftige Richtung, um die Wertigkeit von Geosmin, IAA und seinen Mischungen in verschiedenen Konzentrationen zu untersuchen. Dies könnte durch zusätzliche Modellierung ergänzt werden, um unser Verständnis der zugrunde liegenden Schaltkreise und Prozesse besser zu untermauern und überprüfbare Hypothesen zu generieren, um dieses Verständnis in Frage zu stellen.

Zusammengenommen liefern unsere Daten und unser Modell den ersten Beweis dafür, dass Geosmin das Abwehrverhalten von Honigbienen aufgrund ungewöhnlicher neuronaler Reaktionseigenschaften stark moduliert; eine ökologische Relevanz für Bienen ist daher wahrscheinlich. Die Art dieser Relevanz bleibt rein spekulativ. Für den Menschen dient Geosmin als Wetterindikator. Der Mechanismus, warum der Geruch von Geosmin oft dem Regen vorausgeht, wurde kürzlich enthüllt13: Wenn Regentropfen auf den Boden treffen, erzeugen sie Aerosole, die Staub, Geruchsstoffe und sogar die Geosmin-produzierenden Bakterien selbst manchmal über viele Kilometer hinweg transportieren. Der Frage, ob auch Bienen diese Informationen nutzen, sollte nachgegangen werden. Das Verständnis der Rolle von Geosmin und einer möglichen Beteiligung an der Signalisierung bevorstehenden Regens könnte auch dazu beitragen, Probleme bei der Anpassung von Bienen an den Klimawandel vorherzusehen und so ökologische und wirtschaftliche Schäden zu verhindern.

Von September 2019 bis November 2019 und von Juli 2020 bis August 2020 wurden Honigbienensammler aus verschiedenen Kolonien von Apis mellifera ligustica in Rovereto, Italien, gesammelt. Die Bienenvölker waren während des gesamten Versuchszeitraums frei auf Nahrungssuche und wurden routinemäßigen Bienenzuchtinspektionen unterzogen. In die Verhaltensexperimente wurden jeweils gleich viele Bienen verschiedener Völker einbezogen. Die Bienen wurden an sonnigen und bewölkten Tagen (aber nicht an regnerischen Tagen) in zwei Durchgängen (ca. 10:30 Uhr oder 14:00 Uhr) gefangen.

Beim Verlassen der Bienenstöcke wurden die Häcksler mit einem Plastikbehälter eingesammelt, zurück ins Labor gebracht und in einen Kühlschrank gestellt. Als die Bienen bewegungslos waren, wurden sie paarweise in zu Spritzen umgebaute 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesetzt. Nachdem sich die Bienen vollständig erholt hatten, wurden zwei Tropfen Saccharoselösung (50 % Saccharosewasser, Vol./Vol.) in das Röhrchen gegeben. Alle Honigbienen durften sich mindestens 15 Minuten lang erholen (bis zu ~ 1 Stunde bei den letzten Bienen), bevor sie in der Versuchsanordnung zur Untersuchung des Stechverhaltens getestet wurden. Wenn eine oder beide Bienen Anzeichen einer schlechten Erholung zeigten, als sie in den Aufbau gebracht wurden (Schwierigkeiten, sich auf dem Kopf zu halten, Orientierungslosigkeit und/oder lethargischer Gang), wurde der gesamte Versuch von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Alle zur Aufnahme der Bienen verwendeten Materialien wurden vor der nächsten Verwendung mit 80 %igem Ethanol gewaschen und gereinigt.

Insgesamt nahmen 288 Bienen an den Verhaltensexperimenten teil, gleichmäßig verteilt auf die 6 Geruchsbedingungen (daher eine Stichprobengröße von 48 Bienen pro Gruppe). Diese Stichprobengröße wurde auf der Grundlage früherer Studien ausgewählt19,59.

Alle Düfte wurden von Sigma-Aldrich bezogen (98–99,9 % Reinheit) und bei 4 °C gelagert. Sie wurden zu Beginn des Versuchszeitraums in Mineralöl verdünnt und über die gesamte Dauer des Verhaltensexperiments aufbewahrt. Bei Nichtgebrauch wurden diese Duftstoffe versiegelt und bei Raumtemperatur gelagert. Der Hauptbestandteil des Stichalarmpheromons, Isoamylacetat (IAA), wurde wie in früheren Studien auf 10–1 (Vol./Vol.) verdünnt19,59. Für Geosmin wurden die Konzentrationen 10–3 und 10–6 gewählt, da gezeigt wurde, dass diese bei Fruchtfliegen8 und Mücken10 Verhaltensreaktionen hervorrufen.

Die Gerüche wurden bei Raumtemperatur (24 °C) abgegeben, indem ein mit 10 μl Duftstofflösung getränktes Filterpapier in einen Luftstrom gelegt wurde, der über drei gleichmäßig verteilte Kanäle horizontal in die Testarena injiziert wurde (Abb. 1a). Die Gerüche wurden über 40 gleichmäßig verteilte Löcher im Oberdeckel aus der Arena entfernt. Der Fluss blieb während der gesamten Versuchsdauer (3 Minuten) eingeschaltet. Um die Wechselwirkungen zwischen zwei Gerüchen zu testen, wurden 2 Filterpapiere, die jeweils einen der Gerüche trugen, in den Luftstrom gelegt. Der einströmende Geruchsstrom wird über einen Photoionisationsdetektor (200B miniPID, Aurora Scientific) kontrolliert. Dadurch können jedoch nur die höchsten Geruchskonzentrationen aufgelöst werden und die Reproduzierbarkeit der Bedingungen zwischen den Versuchssitzungen gewährleistet werden. In der Arena führt die turbulente Luftbewegung im Inneren zwangsläufig zu Konzentrationsschwankungen in Raum und Zeit.

Die Stechreaktionsfähigkeit der Bienen wurde mit dem in 19 ausführlich beschriebenen Test getestet. Kurz gesagt, wurden Honigbienendyaden in eine zylindrische Testarena eingeführt, in der sie einer schwarzen rotierenden Puppe gegenüberstanden, die durch eine schwarze Feder verlängert wurde (Abb. 1a, Zusatzfilm 1). Die Hauptfunktion der schwarzen Feder besteht darin, die Bienen zu stören, ohne Schmerzen zu verursachen, indem sie die Seiten der Arena berührt. Beachten Sie, dass die Bienen sowohl Schnuller als auch Feder problemlos meiden können. Ein Versuch dauerte 3 Minuten und wurde als „Stechen“ gewertet, wenn sich während dieser Zeit mindestens eine der Bienen dazu entschloss, den Dummy zu stechen. Dieses Verhalten wurde dadurch definiert, dass die Biene den Schnuller oder die Feder mindestens 3 Sekunden lang festhielt und dabei die Spitze ihres Hinterleibs in der charakteristischen Stechhaltung dagegen drückte. Alle Verhaltensversuche wurden mit einer über der Arena angebrachten Webcam (Microsoft Life Cam) aufgezeichnet.

Es wurden zwei identische Arenen und zwei Dummies verwendet. Ihre Verwendung wurde auf die verschiedenen Geruchsbedingungen abgestimmt, um sicherzustellen, dass sie nicht zu möglichen Verhaltensunterschieden beitrugen. Vor jedem Versuch wurden die Arena und die Dummys mit ihren Federn mit einer 80-prozentigen Ethanollösung gereinigt.

Ein verallgemeinertes lineares Modell (GLM) wurde verwendet, um den Prozentsatz der Stichversuche zu analysieren. Die Geruchsgruppe wurde als fester Faktor festgelegt, während Bienenstock und Puppe als Zufallsfaktoren definiert wurden. Es wurde ein paarweiser Vergleich (glht-Paket in R) durchgeführt, gefolgt von einer Korrektur der falschen Entdeckungsrate (FDR) nach Benjamini und Hochberg zur Kontrolle von Typ-I-Fehlern.

Die EAG-Technik wurde ab 60 angepasst und die Aufzeichnungen wurden mit einem Standard-EAG-Gerät (Syntech, Hilversum) durchgeführt. Honigbienensammler wurden auf die gleiche Weise wie für den Verhaltenstest eingesammelt und behandelt. Nachdem sie auf Eis gekühlt worden waren, wurde eine Antenne jedes Tieres auf Höhe der Landschaft abgeschnitten. Für dieses Experiment wurden insgesamt n = 24 Antennen von der linken und rechten Seite verwendet (14 linke und 10 rechte Antennen), um Lateralisierungseffekte zu vermeiden20. Die Basis jeder Antenne wurde dann in die Glasreferenzelektrode eingeführt, die mit Kaissling-Kochsalzlösung61 gefüllt war, die aus Folgendem bestand: NaCl (7,5 g/l); CaCl2 (0,21 g/l); KCl (0,35 g/l); NaHCO3 (0,2 g/l). Die Aufzeichnungselektrode wurde mit dem letzten Segment des Flagellums in Kontakt gebracht, aus dem die distale Spitze herausgeschnitten worden war. Der aufgezeichnete Spannungsabfall, der durch einen Geruchsreiz hervorgerufen wird, summiert die Depolarisationen in allen aktivierten olfaktorischen Rezeptorneuronen und hängt von der Anzahl der aktivierten Neuronen sowie deren Aktivitätsamplituden ab.

Ein speziell angefertigtes Olfaktometer wurde verwendet, um Gerüche an die Antennen der Bienen zu liefern. Die Geruchsreize stammen aus Glasfläschchen, die 1 ml in Mineralöl gelöste Duftstoffe enthalten. Das Olfaktometer wurde mit LabView betrieben und die einzelnen Kanäle wurden durch Magnetventile (LHDA0531115, The Lee Company) geschaltet, die von einer PCIe-6321-Multifunktionsplatine (National Instruments) gesteuert wurden. Der Luftstrom während der Aufzeichnung wird in allen Phasen des Experiments konstant gehalten (Details siehe 62).

Sieben Mineralöllösungen von entweder Geosmin (Geo) in den Konzentrationen 10–6, 10–5, 10–4, 10–3 Vol./Vol., Isoamylacetat (IAA) in den Konzentrationen 10–3, 10–1 Vol./Vol. oder reines Mineralöl (Kontrolle) wurden hergestellt. Mit diesen Lösungen wurden Olfaktometer-Glasfläschchen gefüllt. Das Stimulationsprotokoll für jede Biene bestand darin, jeden Geruch und eine Kombination von Düften in aufsteigender Konzentrationsreihenfolge zu präsentieren, was zu 15 Reizen führte, siehe Abb. 2b–d: Kontrolle, Geo 10–6, Geo 10–5, Geo 10– 4, Geo 10–3, IAA 10–3, IAA 10–3 + Geo 10–6, IAA 10–3 + Geo 10–5, IAA 10–3 + Geo 10–4, IAA 10–3 + Geo 10– 3, IAA 10–1, IAA 10–1 + Geo 10–6, IAA 10–1 + Geo 10–5, IAA 10–1 + Geo 10–4, IAA 10–1 + Geo 10–3. Die Reizdauer betrug 2 s und das Intervall zwischen den Reizen betrug 20 s. Darüber hinaus wurde jeder Zyklus zehnmal wiederholt und somit wurden jeder Bienenantenne insgesamt 150 Reize präsentiert, was zu Aufzeichnungen mit einer Gesamtdauer von 55 Minuten führte. Der die Antennen erreichende Geruchsstrom wird über einen Photoionisationsdetektor (200B miniPID, Aurora Scientific) überwacht. Dies ermöglicht jedoch nur die Auflösung von Geruchskonzentrationen > 10–5 und dient der Sicherstellung der Reproduzierbarkeit zwischen einzelnen Versuchsdurchgängen sowie zwischen EAG und Calcium-Bildgebung, da nur für diese Versuche eine gleichmäßige Durchströmung des Versuchsbereiches gewährleistet werden kann.

Die Antwortamplitude wurde berechnet, indem die über 1 s vor jedem Reiz gemittelte Spannung von der über 1 s nach Beginn des Reizes gemittelten Spannung subtrahiert wurde. Diese Werte wurden anschließend über die zehn Wiederholungen jedes Reizes gemittelt. Die Antworten wurden mittels ANOVA mit wiederholten Messungen und anschließenden Bonferroni-Post-hoc-Tests analysiert.

Für jede IAA-Konzentration (0, 10–3 und 10–1) wurden Normalisierungen durchgeführt, indem die für jede Geosminkonzentration in Kombination mit jeder Konzentration erhaltenen Reaktionen durch die Reaktion auf den Reiz ohne Geosmin dividiert wurden. Im Fall der Kontrolle (MO) wurde vor der Normalisierung allen Werten 1 hinzugefügt, wodurch Werte zwischen 0 und 1 im Normalisierungsfaktor verhindert wurden. Nach der Normalisierung wurden für statistische Vergleiche nichtparametrische Tests (Friedman-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichen) durchgeführt.

Honigbienen wurden gemäß einem bewährten Protokoll62 auf das In-vivo-Kalziumbildgebungsexperiment vorbereitet. Die verwendeten Häcksler wurden gesammelt und 5–6 Minuten lang bei 4 °C im Kühlschrank immobilisiert. Die immobilisierten Bienen wurden dann mit weichem Zahnwachs (Deiberit 502, Siladent) auf einem speziell angefertigten Bildgebungstisch fixiert. In die Kopfhaut der fixierten Biene wurde ein kleines rechteckiges Fenster geschnitten. Die Drüsen und die Luftröhre wurden zur Seite verschoben und Fura2-Dextran, ein kalziumempfindlicher Fluoreszenzfarbstoff (Thermo-Fischer Scientific), gelöst in destilliertem Wasser, wurde mit einer Mikrospitze in die Antenno-Cerebralis-Bahnen direkt unterhalb des α-Lappens injiziert63. Nach der Injektion wurde die Cuticula mit n-Eicosan im Originalzustand fixiert. Die Bienen wurden etwa 20 Stunden lang an einem dunklen, kühlen und feuchten Ort gelagert, um sicherzustellen, dass der Kalziumfarbstoff in die AL diffundiert ist.

Kurz vor der Bildgebungssitzung wurden das Nagelhautfenster, die Luftröhre und die Drüsen vollständig entfernt. Ein Silikonkleber (Kwik-Sil) wurde verwendet, um das offene Fenster oben auf dem Kopf der Biene abzudecken, und man ließ es einige Minuten trocknen. Das Fluoreszenzsignal im Antennenlappen wurde dann unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop abgebildet.

Das Zwei-Photonen-Mikroskop (Ultima IV, Bruker) basiert auf einem ultrakurzgepulsten Laser (Mai Tai, Deep See HP, Spectra-Physics). Der Laser wurde zur Fura2-Anregung auf 780 nm eingestellt. Alle Bilder wurden mit einem Wasserimmersionsobjektiv (10 \(\times), NA 0,3, Olympus) aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde in Epi-Konfiguration gesammelt, durch einen dichroitischen Spiegel ausgewählt und mit einem Bandpassfilter mit einer Mittenfrequenz von 525 nm und einer Bandbreite von 70 nm (Chroma Technology Corp.) gefiltert. Schließlich wurde es von einer Photomultiplierröhre (Hamamatsu Photonics) nachgewiesen. Laserleistungen von etwa 10 mW wurden verwendet, um das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) gegen Lichtschäden auszugleichen, die die Lebensdauer der Bienen verkürzten.

Das Sichtfeld von 280 × 280 µm2 wurde mit 128 × 128 Pixeln aufgelöst. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einer Tiefe von 13 Bit aufgezeichnet. Die Bildaufnahme mit einer Bildrate von 10,1 Hz wurde mit dem Stimulusprotokoll synchronisiert.

Zusätzlich zu den Funktionsbildern wurde ein Z-Stapel des Antennenlappens mit einer räumlichen Auflösung von 512 × 512 Pixeln und einem Z-Schichtabstand von 2 µm aufgenommen, um die morphologische Identifizierung von Glomeruli durchzuführen.

Das Olfaktometer, das zur Bereitstellung von Gerüchen unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet wurde, war dasselbe, das auch im EAG-Experiment verwendet wurde. Während einer Bildgebungssitzung wurden der Biene die interessierenden Geruchsstoffe (Geosmin 10–6, Geosmin 10–3 und 10–1 IAA) in einer Sequenz präsentiert, entweder als einzelner Geruch oder als Mischungen, und die Sequenz wurde zehnmal wiederholt . Jeder Reizimpuls dauerte 3 s mit einem Intervall zwischen den Reizen von 12 s und ein Absaugsystem entfernt die Gerüche schnell aus dem Versuchsbereich. Zum Vergleich der Reaktionsstärke und -breite wurden auch drei Blumendüfte mit den gleichen Sequenzen getestet (1-Nonanol 5·10–3, Acetophenon 5·10–3 und 3-Hexanol 5·10–3).

Es wurden Signale von insgesamt 14 Bienen aufgezeichnet und analysiert. Die Datenanalyse erfolgte vollständig automatisiert, basierend auf benutzerdefinierten MATLAB-Skripten (R2019b, MathWorks). Die Fluoreszenzzeitreihen, die eine gesamte experimentelle Sequenz enthielten, wurden für jeden Versuch in Zeiträume von 3 s vor dem Reiz, 3 s während des Reizes und 3 s nach dem Reiz unterteilt. Für jedes Bild haben wir die relative Fluoreszenzänderung berechnet

durch Normalisierung des rohen Fluoreszenzsignals \(F\left(t\right)\) durch das durchschnittliche Signal während der Vor-Stimulus-Periode Fb. Dieses Signal ist proportional zur relativen Änderung der Kalziumkonzentration und damit zur neuronalen Feuerungsrate64. ΔF/F wurde über die 10 Versuche für jeden Geruch gemittelt. Als nächstes wurden die 2D-Aktivitätskarten nach einzelnen glomerulären Reaktionen segmentiert. Die glomerulären Grenzen wurden durch rekursiven Vergleich von drei Informationsquellen, den anatomischen Merkmalen aus einem zusätzlich aufgezeichneten 3D-Bildstapel (ergänzende Abbildung 2a), den funktionellen Antwortkarten (ergänzender Film 2) und einer regionalen Homogenitätsanalyse, die die Korrelation zwischen den testet, ermittelt Signale jedes Pixels und die von benachbarten Pixeln. Dieses Maß ist innerhalb einzelner Glomeruli hoch und fällt an ihren Grenzen ab (ergänzende Abbildung 2b). Nachdem kohärent reagierende Strukturen segmentiert wurden, wurde die glomeruläre Identität mithilfe des digitalen 3D-Antennenlappenatlas 23 bestimmt. Die Analyse beschränkte sich auf die 19 am häufigsten identifizierten Glomeruli. Wenn die Identität einzelner Glomeruli nicht mit Sicherheit bestimmt werden konnte, wurden sie verworfen, sodass die Gesamtzahl der analysierten Glomeruli zwischen den Bienen schwankte (Abb. 4c).

Eine statistische Analyse der durchschnittlichen Reaktionen der Probanden auf einzelne Gerüche wurde über gepaarte T-Tests mit FDR-Korrektur durchgeführt.

Die Neuronen im Modell werden durch ein adaptives Leaky-Integrate-and-Fire-Neuron mit einer Membranpotentialgleichung beschrieben

wobei \(\sigma \sim \mathcal{N}\left(\mathrm{0,1}\right)\) normalverteiltes weißes Rauschen ist und der Faktor \(k\) verwendet wird, um Eingangsströme in den ORNs neu zu skalieren. Für olfaktorische Rezeptorneuronen (ORNs) ist der Eingangsstrom der Strom, der durch olfaktorische Rezeptoren (ORs) fließt und \(k=10\), während es sich bei lokalen (LN) und Projektionsneuronen (PN) um die synaptischen Ströme von eingehenden Synapsen handelt mit \(k=1\). Alle Neuronen haben \(C=1\) nF, \({V}_{\text{leak}}=-60\) mV, \({g}_{\text{leak}}=10\) nS und \(A=1,4\) nA. Immer wenn das Membranpotential \(V\) die Zündschwelle \({V}_{th}=-40\) mV überschreitet, wird eine Spitze ausgesendet und das Membranpotential wird auf \({V}_{\text{ zurücksetzen}}=-70\) mV. PNs haben keinen Anpassungsstrom, aber ORNs und LNs haben eine Spitzenratenanpassung mit \({g}_{\text{adapt}}=1,5\) nS für ORNs und \({g}_{\text{adapt }}=0,5\) nS für LNs. Die Anpassungsvariable wurde bestimmt durch

wobei \(\delta\) die Dirac-Delta-Verteilung ist und \({\tau }_{\text{adapt}}=1\) s für ORNs und LNs.

Synapsen werden mit einem sofortigen Anstieg der synaptischen Aktivierung (s) beim Eintreffen einer Spitze und einem anschließenden exponentiellen Abfall beschrieben.

und ein leitfähigkeitsbasierter Eingangsstrom in das postsynaptische Neuron,

mit Umkehrpotential \({V}_{\text{rev}}=0\) mV für Erregung (ORN zu PN, ORN zu LN, PN zu LN) und \({V}_{\text{rev}} =-80\) mV für inhibitorische (LN zu PN und LN zu LN) Synapsen.

Riechrezeptoren und der Transduktionsprozess werden durch ein standardmäßiges zweistufiges Bindungs- und Aktivierungsratenmodell beschrieben (siehe z. B. 65,66,67,68).

wobei \({r}_{0}\) der Anteil der ungebundenen Rezeptoren ist, \({r}_{i}\) der Anteil der an Gerüche gebundenen Rezeptoren \(i=1, \dots , N\), und \({r}_{i}^{*}\) sind die Anteile der Rezeptoren, die an Gerüche \(i\) gebunden und durch diese aktiviert werden. Die Konstanten \({k}_{1}^{i}\) und \({k}_{2}^{i}\) beschreiben jeweils die Geschwindigkeit der Bindung an und der Aktivierung durch Geruch \(i\ ), während \({k}_{-1}^{i}\) und \({k}_{-2}^{i}\) die Entbindung und Inaktivierung beschreiben. Alle \(k\)-Konstanten können spezifisch für die Gerüche und Rezeptortypen sein. In dieser Arbeit haben wir individuelle Konstanten \({k}_{1}^{i}\) für jedes Geruchs-Rezeptor-Typ-Paar und geruchsspezifische (aber für alle Rezeptortypen gleiche) \({k}_{2) gewählt }^{i}\). \({k}_{-1}^{i}={k}_{-2}^{i}=0,025\) kHz waren für alle Gerüche und Rezeptortypen identisch.

Die individuellen Bindungskonstanten für jeden Geruchsstoff über die Rezeptoren hinweg wurden als Gaußsche Profile ausgewählt.

wobei \(\pi \left(\cdot \right)\) eine (zufällig gewählte) Permutation von \(1,\dots ,{N}_{\text{glo}}\) ist und \(\eta\ ) ist eine \({\mathcal{N}}_{1.5,{0.5}^{2}}\) verteilte Zufallsvariable, gekürzt auf Werte innerhalb von \(\left[0, 4\right]\). Die Standardabweichung \(\sigma\) der Geruchsprofile wurde aus \({\mathcal{N}}_{3,{0,5}^{2}}\ entnommen und auf Werte größer oder gleich 1,5 gekürzt Einheiten von kHz.

Die Aktivierungskonstante \({k}_{2}^{i}\) für jeden Geruch wurde aus \({\mathcal{N}}_{0,02,{ 0,02}^{2}}\ entnommen und auf gekürzt Werte innerhalb von \(\left[0.0028, 0.2\right]\), in Einheiten von kHz.

Für die Simulationen in dieser Arbeit haben wir nach diesen Regeln 98 Gerüche und zwei weitere Gerüche generiert, die wir mit IAA und Geosmin identifizieren. Für „IAA“ gingen wir von einer vergleichsweise geringen Sensitivität von \({\eta }^{\text{IAA}}=0,8\) und einem schmalen Antwortprofil mit \({\sigma }^{\text{IAA}} aus. =3\). Die Aktivierungsrate war mit \({k}_{2}^{\text{IAA}}=0,1\) sehr hoch. Für „Geosmin“ haben wir eine hohe Empfindlichkeit \({\eta }^{\text{geo}}=4,4\) und ein breites Antwortprofil mit \({\sigma }^{\text{geo}}=10\ angenommen. ), während die Aktivierungsrate moderat war, \({k}_{2}^{\text{geo}}=0,003\). Die wahren Werte dieser Parameter sind unbekannt und die hier gewählten Werte wurden letztendlich so ausgewählt, dass die „IAA“- und „Geosmin“-Antworten die Eigenschaften aufwiesen (starke monoton wachsende Reaktion und verschwindende Reaktion mit zunehmender Konzentration), die wir als machbar demonstrieren wollten diese Art von Modell. Wir haben die Gerüche „IAA“ und „Geosmin“ mit einem festen Abstand von 30 OR-Typen von Spitze zu Spitze erzeugt, bevor wir beide mit der gleichen Permutation vermischt haben. Dadurch wird sichergestellt, dass die beiden Gerüche ein bestimmtes Maß an Überlappung aufweisen, was sich insbesondere auf die Wechselwirkungen im OR an der Antenne auswirkt, wie durch die ORN-Spike-Zählungen nachgewiesen wird.

Das Modellnetzwerk ist in Abb. 4a dargestellt. Wir haben 160 Rezeptortypen simuliert69. Witthöft70 berichtete über 5776 plakoide Sensillen auf der Antenne einer Arbeiterbiene mit 12–20 ORNs in jedem Sensillum, also im Bereich von insgesamt 69.312 bis 115.520 ORNs. Wir haben 10 ORNs in einem einzigen Modellneuron mit zehnmal höheren Feuerraten für numerische Effizienz modelliert, d. h. 60 ORN-Modellneuronen pro Typ, insgesamt 9600. Dies ist eine gängige Praxis bei der Modellierung olfaktorischer Systeme, die genau dort auftritt, wo ORNs als Poisson-Prozesse modelliert werden, und eine gute Näherung für andere Neuronenmodelltypen. Beachten Sie, dass davon ausgegangen wird, dass alle ORNs nicht interagieren, was diese Vereinfachung ermöglicht. Der AL hat schätzungsweise 800 PNs71,72, was 5 simulierten PNs pro Glomerulus und 4000 LNs70, also 25 simulierten LNs pro Glomerulus, entspricht. Siehe auch23 für ein sehr ähnliches veröffentlichtes Modell. Jeder der 5 PNs und 25 LNs in einem Glomerulus ist mit 12 zufällig ausgewählten ORNs seines Rezeptortyps verbunden. PNs erregen alle LNs in ihrem Glomerulus und LNs hemmen alle PNs und LNs in allen Glomeruli außer ihrem eigenen, wodurch ein allgemein angenommenes Netzwerkmotiv der All-to-All-Lateralhemmung umgesetzt wird. Die Synapsenparameter für diese Verbindungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Differentialgleichungen wurden mit einem linearen Euler-Algorithmus und einem globalen Zeitschritt von 0,2 ms integriert.

Die Modelle wurden mithilfe der PyGeNN-Schnittstelle73 für GeNN 4.5.074,75 implementiert. GeNN ist unter https://github.com/genn-team/genn verfügbar und der Quellcode für die Modellierungsarbeit in diesem Dokument ist unter https://github.com/tnowotny/bee_al_2021 verfügbar, einschließlich Jupyter-Notebooks zur Analyse und Darstellung . Die Simulationen wurden auf einer Linux-Workstation mit Ubuntu 18.04.5 LTS ausgeführt.

Die Monotonie der Antwort x (x = maximale Spike-Dichte-Funktion (SDF) oder gemittelte SDF, jeweils über alle Glomeruli) wurde in diesem Zusammenhang berechnet als.

Das heißt, die Differenz zwischen dem SDF bei der höchsten getesteten Geruchskonzentration (\({10}^{-1})\) und dem höchsten beobachteten SDF, normalisiert durch den mittleren beobachteten SDF, wobei das Maximum und der Mittelwert über alle Konzentrationen hinweg genommen wurden \({10}^{-7}\) zu \({10}^{-1}\). Monotonie nimmt Werte an, die kleiner oder gleich 0 sind, und monotone Gerüche haben \(m=0\).

Wir haben Spike Density Functions (SDF) als Schätzung der gleichmäßigen Feuerrate berechnet76. Die SDF wurde durch die Faltung des Spike-Zugs (als Punktprozess verstanden) mit einer Gaußschen Kernelfunktion berechnet.

mit \(\sigma =100\) ms.

Die im Rahmen der aktuellen Studie erfassten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor ([email protected]) erhältlich, der Quellcode für die Modellierung ist unter https://github.com/tnowotny/bee_al_2021 verfügbar.

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Referenzen herunterladen

FS wurde von MIUR [PRIN 2017MKNP2F] unterstützt. ET wurde von der Universität Trient unterstützt [strategisches Projekt BRANDY]. AC wurde von der Autonomen Provinz Bozen gefördert [Projekt B26J16000310003]. MN wurde durch Mittel des Zukunftskollegs (Universität Konstanz) und des Erasmus + Personalmobilitätsprogramms gefördert. TN wurde vom EPSRC [P/P006094/1, EP/S030964/1], einem Leverhulme Trust Research Project Grant und dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union [Fördervereinbarung Nr. 945539 (HBP)] unterstützt.

Amelie Cabirol

Derzeitige Adresse: Abteilung für grundlegende Mikrobiologie, Universität Lausanne, CH-1015, Lausanne, Schweiz

Fachbereich Physik, Universität Trient, 38120, Trient, Italien

Florence Scarano & Albrecht Haase

Zentrum für Geistes-/Gehirnwissenschaften (CIMeC), Universität Trient, 38068, Rovereto, Italien

Florencia Scarano, Mukilan Deivarajan Suresh, Ettore Tiraboschi, Amélie Cabirol und Albrecht Haase

Fachbereich Biologie, Universität Konstanz, 78457, Konstanz, Deutschland

Morgane Nouvian

Zukunftskolleg, University of Konstanz, 78464, Konstanz, Germany

Morgane Nouvian

School of Engineering and Informatics, University of Sussex, Brighton, BN1 9QJ, Großbritannien

Thomas Nowotny

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FS führte die EAG-Aufzeichnung durch und analysierte sie, MS, AC und MN führten und analysierten die Verhaltensexperimente, ET führte und analysierte die Calcium-Bildgebungsexperimente, TN entwickelte, führte und analysierte die Computermodellierung, AH stellte Finanzmittel und Instrumente bereit und überwachte die Studie. Alle Autoren haben zur Erstellung und Überarbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Thomas Nowotny oder Albrecht Haase.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Scarano, F., Deivarajan Suresh, M., Tiraboschi, E. et al. Geosmin unterdrückt Abwehrverhalten und löst bei Honigbienen ungewöhnliche neuronale Reaktionen aus. Sci Rep 13, 3851 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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Eingegangen: 24. Oktober 2022

Angenommen: 01. März 2023

Veröffentlicht: 08. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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