Neuartige Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung von Mycoendophyten: industrielle Bioverarbeitungsstrategien und Skalierung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2052 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dieser Bericht liefert die erste Beschreibung der Mykosynthese von stäbchenförmigen MnO-NPs mit einer durchschnittlichen Kristallitgröße von ~ 35 nm unter Verwendung extrazellulärer bioaktiver Metaboliten des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 als Verkappungsmittel/Reduktionsmittel und MnCl2·4H2O als Ausgangskomponente . Das Weizenkleiemedium wurde für die Züchtung des endophytischen Stamms EG92 ausgewählt, der eine Vielzahl bioaktiver Metaboliten in der extrazellulären Fraktion produzierte, was die Ausbeute an MnO-NPs auf 9,53 g/l steigerte. Die gesamten Medium- und Pilzwachstumsbedingungen, die die Biomasseerzeugung beeinflussten, wurden als aufeinanderfolgende statistische Optimierungsansätze optimiert (Plackett-Burman- und Box-Behnken-Designs). Die Produktionsverbesserungen wurden bei pH 5,5, WBE (35 %) und Inokulumgröße (10 %) erreicht, was Xmax auf das Zwölffache erhöhte (89,63 g/l); Dadurch erhöhte sich Pmax auf das Achtfache (82,93 g/l). Nach 162 Stunden wurden Xmax (145,63 g/l) und Pmax (99,52 g/l) auf der Seite von µmax und YX/S mit 0,084 bzw. 7,65 bestimmt. Mithilfe des Taguchi-Versuchsdesigns wurde die durch Pilze hergestellte MnO-NPs-Reaktion durch Zugabe von 0,25 M MnCl2·4H2O zu 100 % des Pilzextrakts (Reduktions-/Abdeckmittel) und durch Einstellen des pH-Werts der Reaktion auf ~5 verbessert. Diese Reaktion wurde bei 60 °C inkubiert 5 Stunden lang bei C trocknen lassen, bevor 20 % Pilzextrakt (Stabilisierungsmittel) hinzugefügt werden. Außerdem stieg Pmax im Vergleich zum BC um das 40-fache (395,36 g/l). Unsere mykosynthetisierten MnO-NPs zeigen schnellere und präzisere antagonistische Wirkungen gegen phytopathogene Bakterien als Pilze; Sie könnten als alternatives und versprochenes Nano-Bio-Pestizid eingesetzt werden, um in Zukunft eine Vielzahl verschiedener Arten von Krankheitserregern zu bekämpfen.

Heutzutage nimmt die Anwendung der Nanotechnologie bei verschiedenen therapeutischen und landwirtschaftlichen Aktivitäten exponentiell zu, beispielsweise bei Antibiotika, Krebsmitteln, antimikrobiellen Wirkstoffen und Biodüngern1. Eine der Herausforderungen in der modernen Nanotechnologie ist die Entwicklung zuverlässiger und sicherer Protokolle für die Synthese von Nanopartikeln. Bei der Synthese so vieler Nanopartikel und Nanostrukturen wurden unterschiedliche physikalische und chemische Techniken eingesetzt. Kürzlich wurde berichtet, dass diese Methoden aufgrund der Abhängigkeit von unsicheren Substanzen, die potenzielle Risiken für das Ökosystem darstellen könnten, gefährliche und teure Methoden seien2. Daher sollte die Erforschung innovativer, kostengünstiger, ungiftiger und umweltfreundlicher nachhaltiger Ansätze von entscheidendem Interesse sein. Daher hat die grüne Nanotechnologie die Entwicklung kostengünstiger und ökologisch nachhaltiger Techniken zur Herstellung metallischer Nanopartikel vorgeschlagen.

Es gibt viele Metalle und Metalloxid-Nanopartikel wie Ag-, Au-, Fe2O3-, CaO-, MgO-, TiO2-, ZnO- und CuO-Nanopartikel, die aus verschiedenen biologischen Quellen biosynthetisiert wurden3,4,5,6,7. Pilze, Bakterien, Pflanzen und sogar Algen können effektiv als grüne Fabrik zur Herstellung von Nanopartikeln genutzt werden, die ein enormes Anwendungspotenzial bergen, insbesondere im biomedizinischen und landwirtschaftlichen Bereich8,9,10. Daher kann die grüne Synthese von Nanopartikeln durch die produzierten bioaktiven Metaboliten wie Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Alkaloide, Phenole und sogar Enzyme gesteuert werden, die als Reduktionsmittel und Stabilisierungsmittel verwendet werden. Aufgrund ihrer pathogenen Eigenschaften konnten verschiedene biologische Quellen jedoch nicht in der Landwirtschaft eingesetzt werden. Daher ist es sehr plausibel, dass sichere bioaktive Moleküle verwendet werden könnten, die aus sicheren biologischen Zellen extrahiert werden könnten2,11. Es gibt mehrere in der Rhizosphäre isolierte Mikroorganismen (Bodenmikroben), die größtenteils als Nanopartikel-Synthesizer exponiert wurden. Wenige Berichte über Endophyten (Pflanzengewebe-Mikroben). Daher ist es wichtig, sich auf diese vielversprechenden biologischen Wege von Nanofabriken zu konzentrieren, die verschiedene metallische Nanopartikel mit attraktiven Größen und Formen für verschiedene biologische Anwendungen produzierten, einschließlich antimikrobieller, zytotoxischer und antioxidativer Eigenschaften12,13. Mikroorganismen wie Bakterien, Actinomyceten und Pilze, die in Pflanzengeweben oder -zellen leben, ohne ihren Wirt zu schädigen, werden Endophyten genannt. Sie betrachteten attraktive Kandidaten für die Eröffnung einer neuen Linie professioneller Biosynthesesysteme im Zusammenhang mit Biologie und Nanotechnologie. Dieser Ansatz ist kostengünstig, ökologisch nachhaltig und kann Nanopartikel mit einer besser spezifizierten Größe und Form ohne viele Metallionen liefern14,15. Pilzendophyten (Mycoendophyten), insbesondere Trichoderma spp., produzieren eine Vielzahl neuartiger sicherer bioaktiver Metaboliten (Flavonoide, Alkaloide, Polysaccharide und Enzyme), die als potenzielle Quelle für die Herstellung von Nanopartikeln durch intrazelluläre und extrazelluläre Methoden genutzt werden könnten. Denn sekretierte intra- und extrazelluläre bioaktive Moleküle spielen die Hauptrolle bei der Biosynthese von Nanopartikeln (Bottom-up-Ansatz), indem sie Metallsalze und dann Metallionen reduzieren. Die pilzvermittelte umweltfreundliche Herstellungsmethode von Nanopartikeln hat neben der Kosteneffizienz einer Biomasse-Produktionslinie viele Vorteile, wie z. B. die einfache Skalierung des Fermentationsprozesses, die nachgelagerte Verarbeitung und das Potenzial zur effizienten Herstellung von Nanopartikeln . Daher wurde eine Vielzahl von filamentösen Pilzen effektiv für die extrazelluläre und intrazelluläre Biosynthese verschiedener Metalle und Metalloxid-Nanopartikel eingesetzt3,16.

Mehrere Berichte befassen sich mit der Biosynthese oder (grünen Synthese) von MnO-NPs unter Verwendung von Pflanzen- und Bakterienextrakten; Allerdings berichtet keine Studie über die Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung der extrahierten bioaktiven Metaboliten aus Pilzen, insbesondere mykoendophytischen Stämmen. Dabei hat die Anwendung von Pilzzellen als grüner Produzent für die Biofabrikation von Nanopartikeln großes Interesse in der Nanobiotechnologie-Gemeinschaft geweckt. Außerdem wurden für die industrielle Vergrößerung der Biosynthese von Nanopartikeln neben allen mikrobiellen Kultivierungsbedingungen verschiedene physikalisch-chemische Parameter optimiert, um homogene MnO-NPs mit zufrieden stellender antimikrobieller Aktivität herzustellen. Somit wurden alle oben genannten Ziele erfolgreich statistisch untersucht, um die industrielle Produktionslinie für MnO-NPs unter Verwendung eines der kompetenten Endophyten zu erreichen.

Je nach Anwendungsgebiet umfasst die Nanotechnologie verschiedene Ansätze für Nanostrukturmaterialien wie physikalische, chemische und biologische Techniken. Da sich die biologische Herstellungsmethode als vielversprechende umweltfreundliche Technik herausgestellt hat, um die Nebenwirkungen physikalischer und chemischer Herstellungsmethoden zu überwinden8. Daher entstand kürzlich ein neuer Zweig der Nanotechnologie mit dem Titel „Nanobiotechnologie“, bei dem Nanopartikel auf biologische Weise unter Verwendung extrahierter bioaktiver Metaboliten aus biologischen Einheiten wie Pflanzen, Algen, Bakterien und Pilzen hergestellt wurden1,9,10,17. Diese biologische Methode gilt als kommerziell realisierbare, saubere, umweltfreundliche und ungiftige Technik zur Herstellung einiger Nanopartikel, die in der Medizin und Landwirtschaft eingesetzt werden12,18. Für die Vergrößerung hergestellter Nanopartikel tauchte in der Nanotechnologie ein neuer Ausdruck auf, der „industrielle Nanotechnologie“ genannt wurde. Heutzutage ist die Herstellung von Nanopartikeln in großem Maßstab eine zwingende Voraussetzung für die Entwicklung mehrerer Industrien, ohne die menschliche Gesundheit und die Umwelt durch den Einsatz giftiger Substanzen oder hoher Energie zu zerstören15,19. So entstand ein neues vielversprechendes wissenschaftliches Gebiet namens industrielle Nanobiotechnologie. Der kostengünstige biologische Prozess wurde angewendet, um die in der vorliegenden Arbeit berichteten Gesundheitsrisiken und Umweltschäden zu reduzieren.

In jüngster Zeit wurden Pilzzellen als wirksame Biofabriken für die Herstellung einiger Nanopartikel entdeckt, da sie über verschiedene bioaktive Metaboliten verfügen. Da die meisten Pilze eine geringe Anzahl an Nährstoffen benötigen, einfach zu handhaben und filtrierbar sind, werden die Pilze aufgrund der Einsparung erheblicher Investitionskosten für die Herstellung von Nanopartikeln gegenüber anderen biologischen Zellen bevorzugt3. Mykoendophyt (Endosymbiont) hemmt Pflanzengewebe, ohne die Wirtszellen zu zerstören. In den letzten Jahrzehnten haben diese Mykoendophyten aufgrund ihrer unbegrenzten Produktion bioaktiver Metaboliten wie Phenol, Steroide, Flavonoide, Peptide usw. große Aufmerksamkeit erregt20,21,22. Diese Mykoendophyten sind als potenzielle Quelle gemischter bioaktiver Metaboliten, die für die Biosynthese von Nanopartikeln verwendet werden, relativ unerforscht1,8. Ein vielversprechender antimikrobieller Wirkstoff könnten zwar organische Metaboliten sein; zum Beispiel Enzyme oder anorganische Verbindungen als Metalle, abhängig von ihrer breitbandigen antimikrobiellen Aktivität und ihrer Verträglichkeit gegenüber industriellen Verarbeitungsbedingungen im großen Maßstab5. Kürzlich wurden Metalloxid-Nanopartikel aufgrund ihrer möglichen Anwendungen in der Lebensmittelsicherheit je nach Form, Größe, Stabilität und Oberflächeneigenschaften als potenzielle Klasse antimikrobieller Wirkstoffe untersucht16,23,24. Insbesondere MnO-NPs weisen bedeutende charakteristische physikalische, chemische, elektrische, magnetische und katalytische Eigenschaften auf, die umfangreiche Forschungsinteressen betrafen. Die meisten wissenschaftlichen Berichte konzentrierten sich neben der Anwendung von MnO-NPs anhand ihrer elektronischen Eigenschaften und katalytischen Aktivitäten auf die Abschätzung chemischer, physikalischer und katalytischer Eigenschaften. seine antimikrobiellen Aktivitäten wurden jedoch selten untersucht24. Mehrere Berichte befassen sich mit der Biosynthese oder (grünen Synthese) von MnO-NPs unter Verwendung von Pflanzen- und Bakterienextrakten; Allerdings berichtet keine Studie über die Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung der extrahierten bioaktiven Metaboliten aus Pilzen, insbesondere mykoendophytischen Stämmen25. Die Erforschung mykosynthetisierter MnO-NPs mithilfe sicherer, kostengünstiger und einfachster potenzieller Biofabriken wie Trichoderma sp. weist daher neuartige antimikrobielle Aktivitäten auf, die in vielen Bereichen, insbesondere im Agrarsektor, als effiziente moderne Anwendung gelten. Dabei wurden verschiedene mykoendophytische Isolate zur Synthese von MnO-NPs verwendet, da die endgültige Reaktion leicht an der Farbänderung von Gelb nach Rotbraun zu erkennen war. Anschließend wurden die hergestellten MnO-NPs als antimikrobielles Mittel gegen Phytopathogene getestet. Anschließend wurde das kompetente Isolat ausgewählt, das die wirksamsten MnO-NPs als antimikrobielles Mittel produzierte. Da die vielversprechendsten antibakteriellen Aktivitäten (P ≤ 0,05) gegen phytopathogene Bakterien wie Erwinia amylovora (34,0 ± 2,69 mm) verzeichnet wurden, gefolgt von Acetobacter pasteurianus (30,0 ± 2,45 mm) und Erwinia persicina (28,5 ± 5,4 mm). Außerdem wurden die mykosynthetisierten MnO-NPs als Antimykotikum getestet und die höchsten antimykotischen Aktivitäten wurden gegen Aspergillus flavus (24,5 ± 3,20 mm) und Aspergillus niger (20,5 ± 2,06 mm) gemessen, gefolgt von Fusarium solani (19,25 ± 3,26 mm). wie in Tabelle 1 gezeigt. Als Ergebnis wurde das ausgewählte Isolat anhand der angegebenen rDNA-Sequenzdaten mithilfe der GenBank-Blast-Analyse genetisch identifiziert. Dieses Isolat wurde in der GenBank-Datenbank als endophytischer Trichoderma virens-Stamm EG92 mit der Zugangsnummer MF429775 eingereicht, da es völlig ähnlich zu Trichoderma virens war, wie in Abb. 1 dargestellt.

Phylogenetischer Baum und Diversität der Teilsequenz der ribosomalen RNA-Gene kleiner und großer Untereinheiten (interner transkribierter Spacer 1, 5.8S ribosomales RNA-Gen und interner transkribierter Spacer 2) im endophytischen Trichoderma virens-Stamm EG92 (MF429775) im Vergleich zu Referenzstämmen. Dieser Baum wurde mithilfe der Neighbour-Joining- und Maximum-Likelihood-Analyse (MEGA10.1.7-Software 2020) erstellt. Die Sequenzdivergenz wird durch einen Maßstabsbalken angezeigt.

In dieser Studie wurden die mykosynthetisierten MnO-NPs erstmals mit bloßem Auge erkannt, als sich die Reaktionsfarbe von gelb zu gelblich-brauner und rotbrauner Suspension änderte, wie in Abb. 2B, C dargestellt; aufgrund der Anregung der Oberflächenplasmaschwingungen26. Darüber hinaus nehmen die Peaks der UV-Vis-Absorptionsintensität mit der maximalen Absorption bei 350 nm zu, was die Mykosynthese von MnO-NPs bestätigt, wie in Abb. 2A gezeigt. Die Reaktionsfarbe und das UV-Vis-Spektrum deuten also darauf hin, dass die Mykosynthese gut reduzierter/stabilisierter MnO-NPs erfolgreich abgeschlossen wurde. Die UV-Vis-Spektroskopie ist die am weitesten verbreitete Technik zur Untersuchung der optischen Eigenschaften hergestellter Nanopartikel durch den Nachweis des breiten Absorptionspeaks18,27. Den früheren Berichten zufolge lagen die UV-sichtbaren Absorptionsspektren von MnO-NPs aufgrund von n → π⃰- und π → π⃰-Übergängen im Bereich von 284 bis 400 nm 11, 24, 25. Darüber hinaus deuteten unterschiedliche Absorptionspeaks von MnO-NPs auf unterschiedliche Form- und Größenvariationen der hergestellten Nanopartikel gemäß der Synthesemethode hin1,10.

(A) UV-Vis-Spektren von durch Pilze hergestellten MnO-NPs zeigen einen Oberflächenplasmonresonanzpeak bei 350 nm, (B) die endgültig hergestellten MnO-NPs, (C) den Extrakt des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 und (D) SEM-Bild von Durch Pilze hergestellte MnO-NPs zeigen ihre stäbchenförmige Struktur.

Bisher waren unterschiedliche Formen und Größen synthetisierter Nanopartikel von Reduktions-/Verkappungsmitteln abhängig6,25. Daher wurde SEM verwendet, um die morphologischen Eigenschaften unserer mykosynthetisierten MnO-NPs zu analysieren. Der morphologische Charakter der hergestellten MnO-NPs wurde durch REM-Untersuchung nachgewiesen (Abb. 2D), die die während der Biosynthesereaktion aufgetretene Agglomeration zeigt. Das REM-Bild zeigt sehr deutlich gebildete MnO-NPs mit stäbchenförmiger Morphologie. Außerdem wurde seine Elementzusammensetzung mittels EDX-Analyse bestimmt, die ein starkes und mehrere Signale von Mn zusammen mit einem Signal von O zeigt, die möglicherweise von den bioaktiven Metaboliten (abschließenden organischen Materialien) stammen (Abb. 3A). Außerdem zeigt das EDX-Profil die mykosynthetisierten MnO-NPs als hochreinen Gehalt bestehend aus Mn (64,45 %) und O (35,5 %).

Charakterisierung von durch Pilze hergestellten MnO-NPs unter Verwendung des Extrakts des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 mittels EDX-Analyse (A), TGA-Thermoprofil (B) und XRD-Analyse (C).

Abbildung 3B zeigt das TGA-Thermoprofil von mykosynthetisierten MnO-NPs, die bei verschiedenen Temperaturen bis zu 800 °C getestet wurden. Die resultierende Steigung der TGA-Kurve zeigt einen geringen Gewichtsverlust von etwa 5,5 %, der bei 815 °C beobachtet wurde, was möglicherweise auf die Freisetzung von Wasser, nicht reagierten und beschichteten bioaktiven Metaboliten zurückzuführen ist, die die Oberfläche mykosynthetisierter MnO-NPs umgeben. Auch das XRD-Muster mykosynthetisierter MnO-NPs unter Verwendung des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 stimmt vollständig mit dem Standardmuster von körperzentriertem tetragonalem α-MnO (JCPDS-Datei Nr. 44-0141) überein, das die Produktion von MnO-NPs bestätigt erfolgreich durchgeführt (Abb. 3C). Die scharfen Beugungspeaks wurden bei 2θ von 18,56°, 28,90°, 37,34° und 63,74° detektiert, die in (200), (310), (211) bzw. (512) Facetten indiziert waren. Mithilfe von XRD-Mustern wird die durchschnittliche Kristallitgröße für mykosynthetisierte MnO-NPs unter Verwendung der Scherrer-Formel mit 35 nm berechnet.

Alle Endophyten produzierten unterschiedliche Sekundärmetaboliten (Flavonoide, Terpenoide, Zucker, Ketone, Aldehyde, Carbonsäuren usw.), um ihre Wirte vor Fressfeinden und Stressbedingungen zu schützen25,28. Diese bioaktiven Metaboliten könnten für die Reduzierung von Nanopartikeln verantwortlich sein18,29. Daher wurden die extrahierten sekundären Pflanzenstoffe aus dem getesteten endophytischen Trichoderma virens-Stamm EG92 analysiert. FTIR-Spektroskopie wurde verwendet, um die bioaktiven Metaboliten im Pilzextrakt zu identifizieren, die als reduzierende, verschließende und stabilisierende Mittel an der Herstellungsreaktion von MnO-NPs beteiligt sind; wie in Abb. 4A gezeigt. Da die Möglichkeit besteht, dass Biomoleküle für die Verkappung/Stabilisierung mykosynthetisierter MnO-NPs verantwortlich sind; besonders geringer Gehalt an anorganischen und organischen Stoffen, die mittels FTIR-Analyse nachgewiesen werden können. Die scharfen Absorptionspeaks wurden bei ν 3921 cm−1 (O-H-Streckschwingung), ν 2117 cm−1 (C-C-Streckschwingung), ν 1639 cm−1 (C = Streckschwingung) und ν 1107 cm−1 beobachtet (CH3-Deformationsvibration), ν 1064 cm-1 (Amingruppe), ν 962 cm-1 (eine aromatische Gruppe), ν 759 cm-1 (CH2-Deformationsvibration), ν 644 cm-1 (–OH-Gruppe) und ν 437 cm−1 (C–C-Skelettschwingung). Dies deutet darauf hin, dass verschiedene funktionelle Gruppen an mykosynthetisierten MnO-NPs beteiligt sein könnten.

FTIR-Spektren des Extrakts des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 (A) und der durch Pilze hergestellten MnO-NPs (B).

In Abb. 4B verschwanden verschiedene FTIR-Banden in biosynthetisierten Spektren, wie z. B. ν 1325, 1209 und 1107 cm−1, die den Schwingungen der O-H-, O-H-O- und CH3-Gruppen zugeordnet sind. Außerdem ist die Bande bei ν 1410 cm−1 aufgetreten, was auf das Vorhandensein einer CH-Deformationsschwingung hinweist. Somit konnten diese Veränderungen im FTIR-Spektrum als aktive Gruppen erkannt werden, die zur Vervollständigung der Biosynthese von MnO-NPs verwendet wurden. Während Meta-Sauerstoff-Mn-O-Mn-Biegeschwingungen von mykosynthetisierten MnO-NPs auch in Banden unterhalb von ν 750 cm−1 identifiziert wurden, aufgezeichnet bei ν 615 und 516 cm−1. Das Vorhandensein von Phenolen, Alkaloiden, Kohlenhydraten, Aminosäuren und Proteinbiomolekülen in Pilzextrakten und mykosynthetisierten MnO-NPs könnte bei der Umwandlung von Mn-Ionen in MnO-NPs helfen und diese mit einem Schutzschild aus verschiedenen Biomolekülen überziehen, entsprechend den beobachteten Peaks und Ergebnisse der phytochemischen Analyse.

Pilzzellen produzieren normalerweise wichtige Metaboliten, die toxische Stoffe in ungiftige Stoffe umwandeln. Diese Metaboliten könnten für die Biofabrikation von Nanopartikeln verantwortlich sein, da einige bioaktive Moleküle bei dieser Methode eine Schlüsselrolle spielen30,31,32. Im Allgemeinen wurden Pilzzellen verwendet, um Nanopartikel extrazellulär und intrazellulär zu synthetisieren, insbesondere endophytische Pilze, die viele bioaktive Metaboliten wie Proteine ​​und phytochemische Polypeptide absonderten, und Enzyme außerhalb der Hyphen und andere wurden in Zellen eingeschlossen33. Im Vergleich zu anderen Mikroben haben endophytische Pilze eine größere Toleranz und Bindungsfähigkeit gegenüber Metallsalzen; Daher haben diese Pilzzellen einen Vorteil für die Produktion von Nanopartikeln in großem Maßstab, einschließlich effizienter, kostengünstiger Folgeprozesse. Darüber hinaus ergaben weitere Berichte, dass endophytische Pilze eine langsamere Kinetik aufweisen, sodass Form und Größe der produzierten Nanopartikel über einen langen Zeitraum hinweg stabil sind, insbesondere wenn sie extrazellulär produziert werden31. Hier hing die Biosynthesereaktion von MnO-NPs über den endophytischen Trichoderma virens-Stamm EG92 von seinen produzierten bioaktiven Metaboliten ab, die als reduzierende/verschließende und stabilisierende Mittel verwendet wurden. Die Kultivierung des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 wurde unter Verwendung verschiedener industrieller Pilzmedien untersucht, um die Produktion bioaktiver Metaboliten zu maximieren, wie in Abb. 5 dargestellt.

Verschiedene Medien, die für die Kultivierung des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 ausgewählt wurden, um MnO-NPs herzustellen. Czapek-Dox-Medium (CDM), Hefe-Malz-Medium (YMM), synthetisches Medium (SM), Glucose-Sojabohnenmehl-Medium (GSM), Hefe-Glucose-Medium (YGM) und Weizenkleie-Medium (WBM).

Der endophytische Trichoderma virens-Stamm EG92 ließ sich mit allen getesteten Medien (CDM, YMM, SM, GSM, YGM und WBM) gut züchten. Das geeignete Medium war jedoch WBM, das das höchste Zellmassengewicht (6,91 g/l) und die höchste MnO-NP-Ausbeute (9,53 g/l) produzierte und für weitere Studien ausgewählt wurde. Anschließend wurden die produzierten bioaktiven Metaboliten in zytoplasmatische und extrazelluläre Pilzfraktionen unterschieden, um das leistungsfähige Zellkompartiment zu ermitteln, das zur Maximierung des Massengewichts der MnO-NPs verwendet wird (Tabelle 2).

Der kultivierte endophytische Stamm EG92 produzierte unter Verwendung von WBM Alkaloide und Phenole sowie geringe Mengen an Gesamtkohlenhydraten (14,69 mg/µl) und Gesamtprotein (12,65 mg/µl) in einer zytoplasmatischen Fraktion, die zur Herstellung von MnO-NPs (2,03 g/l) verwendet wurde. . Während die getestete extrazelluläre Fraktion verschiedene bioaktive Metaboliten wie Alkaloide, Tannine, Phenole, Steroide und Terpenoide sowie Mengen an Gesamtkohlenhydraten (21,65 μg/ml) und Gesamtprotein (16,3 mg/µl) aufweist, ergaben sich 9,53 g/l von MnO-NPs. Schließlich wurde WBM ausgewählt, um den endophytischen Stamm EG92 zu kultivieren, der verschiedene bioaktive Metaboliten in extrazelluläre Fraktionen produzierte, wodurch die Ausbeute an MnO-NPs auf 9,53 g/l maximiert wurde. Der Anbau von Trichoderma-Stämmen unter Verwendung von Weizenkleieextrakt wurde durch frühere Berichte stark unterstützt34,35. Da aus landwirtschaftlichen Abfällen gewonnene organische Stoffe im Allgemeinen als ungefährliche, kostengünstige und reichhaltige Nährstoffquelle für die Kultivierung mikrobieller Zellen, insbesondere Pilzzellen, verwendet wurden. Weizenkleieextrakte wiesen viele verfügbare Proteine, Aminosäuren, Elemente und Kohlenhydrate auf und wurden daher bereits früher als geeignetes Wachstumsmedium für den kostengünstigen Anbau von Trichoderma spp. beschrieben. Verwendung von Feststofffermentation; Es wurde jedoch nur selten in einem submersen Fermentationssystem verwendet36.

Bisher wurden verschiedene Ansätze für Optimierungsstrategien angewendet, beispielsweise „one variable at a time“ (OVAT) und „Statistical Design of Experiments“ (DOE)19,25,37. Die OVAT-Strategie gilt als ineffiziente und zeitaufwändige Methode, da alle Variablen separat untersucht wurden und die Wechselwirkungen zwischen diesen Variablen ignoriert wurden. Allerdings könnten DOE-Ansätze diese Probleme überwinden und die Anzahl der Versuche sowie den experimentellen Fehler reduzieren. Die meisten Forscher verwendeten häufig Plackett-Burman- und dann Box-Behnken-Designs zur Optimierung getesteter Variablen. Bei unseren Versuchen wurde die OVAT-Methode verwendet, um den Betriebsbereich für alle Hodenvariablen zu reduzieren, und anschließend wurde DOE angewendet. Wie in Abb. 6 dargestellt, wurden die Faktoren untersucht, die die Mengen der extrahierten löslichen Nährstoffe unter Verwendung von Weizenkleiepulver beeinflussten, um die Biomasse des endophytischen Stamms EG92 und die MnO-NP-Erträge zu maximieren. Da das optimierte Gewicht der Weizenkleie 50 g/l betrug, wirkte sich dies auf das Massengewicht der produzierten Pilzzellen (10,06 g/l) und die MnO-NPs (13,4 g/l) aus, wie in Abb. 6A dargestellt.

Effektive Bedingungen für die Extraktion löslicher Nährstoffe aus Weizenkleiepulver, die die Biomasseproduktion des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 und die anschließende Herstellung von MnO-NPs beeinflussten.

Zusätzlich wurden das maximale Massengewicht der Pilzzellen (10,5 g/l) und die MnO-NPs (14,3 g/l) nach 24 Stunden des Extraktionsprozesses aufgezeichnet (Abb. 6B). Gleichzeitig wurde der pH-Wert der Extraktionslösung auf einen anderen Wert eingestellt, beispielsweise 6, 7 und 8 (Abb. 6C), um den geeigneten pH-Wert für die Maximierung der extrahierten löslichen Nährstoffe aus dem zur Pilzbekämpfung verwendeten Weizenkleiepulver zu ermitteln Anbau. In diesem Fall wurden das maximale Massengewicht der Pilzzellen (10,3 g/l) und MnO-NPs (13,3 g/l) bei pH 6 nachgewiesen. Außerdem wurde die optimale Temperatur für die WB-Extraktion bei 50 °C bestimmt, wodurch die erzeugt wurde maximales Pilzzellmassengewicht (11,5 g/l) und MnO-NPs (14,9 g/l), wie in Abb. 6D gezeigt. Danach wurden schließlich ausreichende Bedingungen für die Extraktion löslicher Nährstoffe aus Weizenkleie geschaffen, indem 50 g Weizenkleie mit 1 l destilliertem Wasser gemischt und der pH-Wert auf 6 eingestellt und dann 24 Stunden lang auf 50 °C erhitzt wurde. Unter diesen Bedingungen wurden das maximale Massengewicht der Pilzzellen und die MnO-NPs bei etwa 15,3 g/l bzw. 22,35 g/l gemessen; das verdoppelte sich gegenüber den Grundbedingungen (BC).

Die Optimierung der Fermentationseinstellungen ist eine entscheidende Einschränkung für die Verbesserung der Wirtschaftlichkeit von Bioraffinerien. Die Response Surface Methodology (RSM) ist ein statistischer Ansatz zur Optimierung und Modellierung mehrerer Variablen. Es wurde verwendet, um die optimalen Prozessbedingungen durch Integration der Versuchspläne mit Interpolation unter Verwendung erster oder zweiter Polynomgleichungen zu bestimmen38,39,40. In dieser Arbeit wurde das Design von Plackett-Burman zunächst verwendet, um die Kultivierungsbedingungen des endophytischen Stamms EG92 durch statistische Erfassung der signifikanten Variablen zu verbessern. Tabelle 3 fasst die Schwankungen des Trockenzellmassegewichts von 20,3 bis 41,30 g/l zusammen und spiegelt die Bedeutung der Untersuchung der Kultivierungsbedingungen für die Optimierung der höchsten Biomasseproduktivität wider. Der Bestimmtheitskoeffizient des Modells (R2) weist darauf hin, dass 97,73 % der Antwortvariabilität durch dieses Modell beschrieben werden könnten, während 2,27 % der Gesamtvariabilität nicht beschrieben werden könnten.

Darüber hinaus war das berechnete F-Verhältnis höher als das theoretische für das Regressionsmodell, was auf seine Signifikanz hinweist (Tabelle 4). Die berechneten Haupteffekte wurden als Diagramm dargestellt, wie in Abb. 7A dargestellt. Da sich alle Variablen mit Ausnahme von Bewegung, pH-Wert und CuSO4 positiv auf das Trockengewicht der Zellmasse auswirken, haben sie auch negative Auswirkungen. Außerdem haben verschiedene signifikante Variablen den höchsten Präsenzbeitrag in diesem Kreisdiagramm, wie z. B. F3 (14 %), F8 (22 %) und F6 (45 %); Daher gelten diese Faktoren als wichtige Variablen für die Erhöhung der endgültigen Trockenzellmasseproduktion für den endophytischen Stamm EG92 (Abb. 7B).

Statistische Analyse, die die Auswirkungen der getesteten Variablen auf die Trockenzellmasse des entophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 gemäß dem Plackett-Burman-Design zeigt. (A) Säulendiagramm des berechneten Haupteffekts der getesteten Variablen, (B) Kreisdiagramm der prozentualen Verteilung jeder Variablen und (C) Pareto-Diagramm stellt den berechneten p-Wert und die Konfidenzniveaus dar.

Darüber hinaus zeigt das grafische Pareto-Diagramm die Rangfolge jeder geschätzten Variablen anhand des Konfidenzniveaus (%) und des p-Werts (Abb. 7C). Nicht signifikante und signifikante Variablen wurden einfach anhand des berechneten Konfidenzniveaus (%) erkannt, da die signifikanten Variablen ein Konfidenzniveau von bis zu 95 % haben, wie z. B. Inokulumalter (98,11 %), pH-Wert (99,4 %), Inokulumgröße (99,96 %). und WBE (99,79 %). Schließlich wurde diese Verbesserung bei Alter des Inokulums (48 Stunden), Rühren (150 U/min), pH 6, CuSO4 (0,01 g/l), Inkubationstemperatur (30 °C), WBE (30 %) und Glucose (10 g/l) erreicht. l), Inokulumgröße (4 %) und MgSO4 (0,1 g/l). Unter diesen Bedingungen erhöhte sich die maximale Trockenzellmasse des endophytischen Stamms EG92 um das Sechsfache (42,68 g/l) im Vergleich zur Verwendung des BC. Anschließend wurden die bioaktiven Metaboliten des Pilzes zur Herstellung von MnO-NPs verwendet, die sich um das Fünffache (55,29 g/l) erhöhen.

Zweitens wurden die ausgewählten drei unabhängigen Faktoren (pH-Wert, WBE und Inokulumgröße) mithilfe des Box-Behnken-Designs statistisch optimiert, um ein maximales Pilzbiomassegewicht zu erzeugen. Da die Niveaus der signifikantesten Variablen zwischen niedrigen (−), mittleren (0) und hohen (+) Werten variierten, stabilisierten sich die nicht signifikanten Variablen auf ihren Werten. Tabelle 5 stellt die Entwurfsmatrix für getestete Variablen dar, die neben experimentellen und vorhergesagten Massengewichten der Trockenzellen sowohl codierte als auch tatsächliche Werte angibt. Die Optimierung signifikanter Variablen, die sich auf die Trockenzellmassengewichte auswirken, wurde über die Regressionsgleichung erreicht, die eine Beziehung zwischen der Antwortvariablen und den codierten Niveaus unabhängiger Variablen generierte (Tabelle *8). Diese Ergebnisse zeigen, dass drei unabhängige Variablen die Mengen an Trockenzellmasse signifikant erhöhen. Seitdem gibt es eine Variation im Trockenzellmassegewicht von 58,18 g/l (Spur 2) bis 86,89 g/l (Spur 13). Dieses Modell ist auf einem hohen Konfidenzniveau signifikant, da der F-Wert um ein Vielfaches höher war als der tabellierte. Der Wahrscheinlichkeits-p-Wert war ebenfalls sehr niedrig (p ≤ 0,05). Das Bestimmtheitsmaß des Modells (R2) gibt 96,47 % der Antwortvariabilität an, die dieses Modell bezeichnen könnte. Gleichzeitig können 3,53 % der Gesamtvariation nicht definiert werden (Tabelle 6). Eine hohe Korrelation (Adj. R2 = 0,90) zeigte auch den Grad der Genauigkeit an, der die hohe Signifikanz des Modells bestätigte.

Zusätzlich wurde das Pareto-Diagramm (Abb. 8A) unter Verwendung des Konfidenzniveaus (%) grafisch dargestellt und p-Werte zeigten die Ränge jeder Variablen; da die signifikanten Variablen ein Konfidenzniveau von bis zu 95 % aufweisen. ANOVA bestimmte den prozentualen Beitrag jeder Variablen und die Wechselwirkungen zwischen den getesteten Variablen. Abbildung 8B zeigt den höchsten Präsenzbeitrag verschiedener Variablen, der bei X22 (40 %) aufgezeichnet wurde, gefolgt von X32 (23 %) und X12 (8 %). Darüber hinaus wurde die höchste Präsenz, die zu Interaktionseffekten signifikanter Variablen beitrug, bei X2X3 (16 %) und X1X2 (6 %) verzeichnet. Daher sind diese Variablen und ihre Mischung wichtig für die Verbesserung des produzierten Trockenzellmassegewichts für den endophytischen Stamm EG92. Ein Polynommodell zweiter Ordnung wurde durch Gleichung angepasst. (4) und die tatsächlichen Werte wurden mit Gl. berechnet. (5) um den optimalen Punkt vorherzusagen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Verbesserung bei pH 5,5, WBE (35 %) und Inokulumgröße (10 %) erreicht wurde, was die maximale Trockenzellmasse des endophytischen Stamms EG92 um das Zwölffache (89,63 g/l) im Vergleich zur Verwendung von BC erhöhte . Anschließend wurden die bioaktiven Metaboliten des Pilzes zur Herstellung von MnO-NPs verwendet, die bis zum Achtfachen (82,93 g/l) anstiegen.

Statistische Analyse der Auswirkungen der getesteten signifikanten Variablen auf die Trockenzellmasse des entophytischen Trichodermavirens-Stammes EG92 gemäß dem experimentellen Box-Behnken-Design. (A) Das Pareto-Diagramm stellt den berechneten p-Wert und das Konfidenzniveau (%) dar und (B) das Kreisdiagramm zeigt die prozentuale Verteilung jeder Variablen.

In dieser Arbeit wurde das submerse Fermentationssystem verwendet, um die Wachstumskinetik des endophytischen Stamms EG92 im Batch-Fermentationsmodus in einem 7-l-Bioreaktor zu untersuchen. Da das untergetauchte Fermentationssystem als einfacher Prozess angesehen wurde, der eine bessere Kontrolle ermöglichte. Mittlerweile wurde die Ausweitung der Produktion von Fadenpilzen durch viele Parameter wie Rührgeschwindigkeit und Luftstromraten beeinflusst. Um den endophytischen Stamm zu maximieren, erzielt das Trockenzellgewicht von EG92 somit die beste MnO-NP-Ausbeute. Die Mischeigenschaften unterschiedlicher Belüftungs-/Rührraten und Zeitabläufe wurden mithilfe von sieben Kontrollstrategien im Batch-Fermentationsmodus (BF) untersucht (Abb. 9). Die kinetischen Ergebnisse zeigten Schwankungen bei Xmax und Pmax, was auf die höchsten physiologischen Aktivitäten in Abhängigkeit von unterschiedlichen Belüftungs-/Rührraten und Zeitpunkt hindeutete. Wie in Abb. 9 dargestellt, erzeugte das verwendete Belüftungs-/Rührregime im B6-Fall (Luftstrom und Rühren so angepasst, dass der DO-Gehalt nicht unter 40 % fiel) den höchsten Xmax (145,63 g/l) und Pmax (99,52 g/l). nach 162 h wurden neben μmax und YX/S 0,084 bzw. 7,65 aufgezeichnet. Daher wird die Anpassung des DO-Gehalts auf ≥ 10 % als wichtiger Faktor angesehen, der das Wachstum des endophytischen Stamms EG92 beeinflusst, der bis zu 21,08 % (145,63 g/l) im Vergleich zum BC ansteigt. Anschließend stiegen die hergestellten MnO-NPs unter Verwendung dieser Konzentrationen bioaktiver Metaboliten um das Zehnfache (99,52 g/l) der Konzentration des basalen Reduktions-/Verkappungsmittels. Am Endpunkt des Batch-Fermentationsmodus wurden die getesteten vier Fütterungsstrategien durch verschiedene Fed-Batch-Fermentationsmodi gestartet. Diese getesteten vier Fed-Batch-Fermentationsmodi (FBF) wurden durch die optimierten Mediumbestandteile oder WBE nur zur Steigerung der Pilzwachstumsproduktion eingerichtet. Wie in Abb. 10 gezeigt, wurden verschiedene Fütterungsstrategien verwendet, um das Verhalten der Zellen des endophytischen Stamms EG92 und der produzierten MnO-NPs zu erklären. Die höchsten Daten wurden bei der Fütterung von WBE über das Fütterungssystem mit exponentiellen Impulsen (FB4) aufgezeichnet. Seitdem wurden Xmax und Pmax nach 48 Stunden bei μmax (0,082) und YX/S (20,69) mit 295,36 bzw. 217,95 g/l aufgezeichnet. Diese Ergebnisse gelten insofern als einzigartig, als sie die endophytische Trichoderma-Biomasseproduktion und damit die MnO-NP-Biosynthese unter Verwendung von Abfallmaterial maximieren, was unseres Wissens noch nie zuvor durchgeführt wurde.

Auswirkungen verschiedener Belüftungs- und Rührregime und deren Zeitpunkt auf das Wachstum des endophytischen T.virens-Stammes EG92, daher das Massengewicht der hergestellten MnO-NPs unter Verwendung eines submersen Fermentationssystems im Batch-Modus in einem 7-l-Bioreaktor. (B1); Der Luftstrom begann bei 1 bis 4,5 vvm/12 h und das Rühren begann bei 100 bis 800 U/min/6 h, (B2) der Luftstrom begann bei 0,5 bis 2 vvm/6 h und das Rühren begann bei 100 bis 800 U/min/3 h, (B3) Luftstrom Start bei 1,5 bis 3,5 vvm/12 h und Rühren bei 50 bis 250 U/min/6 h, (B4) Luftstrom gestartet bei 0,5 bis 2,5 vvm/6 h und Rühren konstant bei 400 U/min, (B5) Luftstrom konstant bei 2 vvm/ 12 Stunden lang und das Rühren begann mit 50 bis 300 U/min/6 Stunden, (B6) Luftstrom und Rühren wurden so eingestellt, dass der Gehalt an gelöstem O2 nicht unter 10 % fiel, und (B7) Luftstrom und Rühren wurden so eingestellt, dass der Gehalt an gelöstem O2 nicht unterschritten wurde 40 %.

Untersuchen Sie die Auswirkungen verschiedener Fed-Batch-Fermentationsmodi auf das Wachstum des endophytischen T. virens-Stammes EG92 und damit das Massengewicht der hergestellten MnO-NPs unter Verwendung eines submersen Fermentationssystems im Fed-Batch-Modus in einem 7-l-Bioreaktor. (FB1) konstante Zufuhr für das gesamte Medium, (FB2) exponentielle Zufuhr von Impulsen für das gesamte Medium, (FB3) konstante Zufuhr für WBE und (FB4) exponentielle Zufuhr von Impulsen für WBE.

Bei der Biosynthese beliebiger Nanomaterialien wird eine Optimierungstechnik eingesetzt, um die idealen experimentellen Bedingungen für die Erzielung der besten und stabilsten Ergebnisse zu finden. Herkömmliche Optimierungssysteme ignorieren Wechselwirkungen zwischen unabhängigen Variablen und die Durchführung vieler Experimente ist zeitaufwändig und teuer. In unserer Arbeit konnte die Auswirkung verschiedener Parameter auf die Biomasseproduktion und die MnO-NP-Ausbeute durch statistisches Versuchsdesign (Taguchi-Methode) gemessen werden, um mithilfe orthogonaler Arrays und Varianzanalyse die besten Bedingungen zu finden. Taguchis experimentelles Design, auch als robustes Parameterdesign bekannt, kann verschiedene experimentelle Bedingungen vergleichen und diejenige mit der geringsten Variabilität als die stärkste auswählen.

Die Taguchi-Entwurfsmethode ist also ein statistisches Optimierungstool, das einfache, effiziente und systematische Ergebnisse liefert, um die Produktion zu maximieren26,41. Zur Untersuchung der einflussreichsten Variablen, die die Produktion von MnO-NPs unter Verwendung von Pilzextrakt als Reduktions-/Verkappungsmittel und MnCl2·4H2O als Ausgangsverbindung (Vorläufer) optimierten, wurde ein Taguchi-Versuchsdesign (TD) mit 25 Pfaden unter Verwendung von 6 Faktoren zu fünf Zeitpunkten geplant Ebenen. Anschließend wurde das Massengewicht der aus Pilzen hergestellten MnO-NPs (Modellreaktion) bestimmt, um die größten S/N-Verhältnisse für jeden Versuch zu berechnen (Abb. 11G). Im Allgemeinen gibt es Schwankungen bei der Zunahme der MnO-NP-Massengewichte von 160,45 ± 1,99 g/l (Spur 5) bis 315,3 ± 0,19 g/l (Spur 19), sodass die getesteten Variablen die Mengen an MnO-NP-Gewichten erheblich erhöhen, wie in ( Tabelle 7).

Eine statistische Auswertung des Einflusses der angegebenen signifikanten Faktoren, einschließlich der Metallvorläuferkonzentration. (V1), Reduktionsmittel-Konz. (V2), Temperatur (V3), pH-Wert (V4), Stabilisatorkonz. (V5) und Reaktionszeit (V6) auf die biogene Produktion von MnO-NPs wurden unter Verwendung des Taguchi-Versuchsdesigns durchgeführt. (A) Reaktionsdiagramm des S/N-Verhältnisses für aus Pilzen hergestellte MnO-NPs, (B) Kreisdiagramm mit prozentualer Verteilung jedes Faktors.

Die Regressionsgleichung wurde aus der Antwort (abhängige Variable) und den codierten Ebenen unabhängiger Variablen generiert (Tabelle 8). Der Bestimmtheitskoeffizient des Modells beträgt R2 = 0,9814, was darauf hinweist, dass 98,14 % der Antwortvariabilität dieses Modells bestimmt werden konnten, während 1,68 % der Gesamtvariabilität nicht definiert werden konnten. Eine hohe Korrelation (Adj. R2 = 0,9751) zeigt auch den Grad der Genauigkeit an, der die hohe Signifikanz des Modells bestätigt. Da das Modell signifikant war, weil der F-Wert mehrmals höher war als der in der Tabelle angegebene. Darüber hinaus zeigten das berechnete Konfidenzniveau (%) und die p-Werte die Ränge jeder Variablen an, da die signifikanten Variablen ein Konfidenzniveau von bis zu 95 % aufweisen. Abbildung 11H zeigt, dass der höchste Anwesenheitsbeitrag für verschiedene Variablen zur Reaktionszeit aufgezeichnet wurde (66 %), gefolgt von der Reaktionstemperatur (17 %) und dem Reaktions-pH-Wert (9 %). Daher werden diese Variablen und ihre Mischung als wichtig für die Erhöhung des Massengewichts von MnO-NPs unter Verwendung des Extrakts des endophytischen T. virens-Stammes EG92 angesehen. Schließlich wurde die Verbesserung der durch Pilze hergestellten MnO-NPs-Reaktion bei MnCl2·4H2O als Ausgangsverbindung (0,25 M), Pilzextrakt als Reduktions-/Verkappungsmittel (100 %), pH-Wert der Reaktion ~ 5 und Reaktionstemperatur (60 °C) erreicht ), Reaktionszeit (5 h) und Pilzextrakt als Stabilisierungsmittel (20 %). Somit war das maximale Massengewicht der durch Pilze hergestellten MnO-NPs bis zum 40-fachen (395,36 g/l) gegenüber dem BC erhöht. Schließlich gilt diese Studie als die erste Studie, die MnO-NPs industriell unter Verwendung extrahierter bioaktiver Metaboliten unter Verwendung endophytischer Trichoderma virens durch statistische Bioverarbeitungsstrategien herstellte. Außerdem wurden die hergestellten MnO-NPs biologisch hergestellt, wobei die extrazellulären bioaktiven Metaboliten des endophytischen Stamms EG92 als Verkappungs-/Reduktionsmittel und MnCl2·4H2O als Ausgangsverbindung verwendet wurden.

Abbildung 12 zeigt die statistischen Bioverarbeitungsstrategien, die zur Steigerung der Produktion des Massengewichts des endophytischen Stamms EG92 und des Massengewichts der durch Pilze hergestellten MnO-NPs angewendet werden. Diese Experimente wurden entwickelt, um die Kultivierungsbedingungen für den endophytischen Stamm EG92 mithilfe von PB- und BB-Designs zu optimieren. Diese Zellen und damit MnO-NPs wurden dann in einem halbindustriellen Bioreaktor unter Verwendung eines untergetauchten Fermentationssystems im BF- und FBF-Modus vergrößert. Da das BF-Kultivierungssystem durch mehrere Belüftungs-/Rührraten verbessert wurde, wurde auch der FBF-Modus verbessert, indem verschiedene Fütterungsstrategien für das gesamte Medium oder WBE verwendet wurden, die den Exponential- oder Impulsmodus verwendeten. Darüber hinaus wurde auch die Herstellungsreaktion der MnO-NPs durch TD optimiert. Im Allgemeinen haben diese statistischen Strategien einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden. Die Endergebnisse zeigten, dass die Trockenzellmasse und die Produktion von durch Pilze hergestellten MnO-NPs zunahmen, wie in Abb. 12 dargestellt.

Zusammenfassung der Bioverarbeitungsstrategien, die zur Optimierung des Massengewichts (g/l) des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 sowie des Massengewichts (g/l) der aus Pilzen hergestellten MnO-NPs unter Verwendung von Plackett-Burman (PB), Box-Behnken angewendet wurden (BB) und Taguchi (TD) experimentelle Designs. Steigerung der Massenproduktion von Pilzen über einen halbindustriellen Bioreaktor (7 l) durch ein submerses Fermentationssystem durch Batch-Fermentationsmodi (BF) und Fed-Batch-Fermentationsmodi (FBF), die schließlich mit den Grundbedingungen (BC) verglichen werden.

Bisher hat sich keine Studie mit der Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung von endophytischem Trichoderma virens-Extrakt als Reduktions-, Verkappungs- und Stabilisierungsmittel befasst, gefolgt von einer industriellen Optimierung der Betriebsvariablen mithilfe verschiedener statistischer experimenteller Methoden und einer anschließenden Hochskalierung der Produktion per Fed-Batch Fermentation.

Verschiedene Konzentrationen hergestellter MnO-NPs wurden hergestellt, um ihre antagonistischen Aktivitäten zu bewerten und MIC, MBC und MFC unter Verwendung verschiedener Phytopathogene nachzuweisen. Tabelle 9 zeigt den Durchmesser der Hemmzonen in Millimetern. Insgesamt wurde die hervorragende MHK für mykosynthetisierte MnO-NPs gegen phytopathogene Bakterien bei 210 µg/ml gemessen, gegen phytopathogene Pilze jedoch bei 330 µg/ml. Bei den phytopathogenen Pilzen wurden die größten Hemmzonen gegen Alternaria alternate (42,75 ± 3,96) gemessen, gefolgt von Helminthosporium sp., (40,38 ± 2,58), die geringste jedoch gegen Phytophthora arenaria mit (28,13 ± 2,97). Gegen phytopathogene Bakterien wurden jedoch die größten Hemmzonen gegen Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34) verzeichnet, gefolgt von Acetobacter pasteurianus (47,81 ± 6,34) und Erwinia carotovora (42,18 ± 2,56). Die niedrigsten Ergebnisse wurden gegen Clavibacter michiganensis (33,75 ± 1,90) und Erwinia persicina (39,37 ± 1,02) festgestellt. Außerdem lagen die erhaltenen MBC-Werte zwischen 200 und 280 µg/ml und die MFC-Werte reichten bis zu 340–440 µg/ml. Im Allgemeinen weisen die mykosynthetisierten MnO-NPs in dieser Studie schnelle und wirksamere antagonistische Aktivitäten gegen phytopathogene Bakterien als gegen Pilze auf. Da unsere mykosynthetisierten MnO-NPs schnellere und genauere antagonistische Aktivitäten gegen phytopathogene Bakterien als gegen Pilze aufweisen, könnten sie in Zukunft als alternatives Nano-Bio-Pestizid zur Bekämpfung verschiedener Krankheitserreger eingesetzt werden. MnO-NPs verfügen über mehrere einzigartige Eigenschaften, beispielsweise die Fähigkeit, schnell in Krankheitserregerzellen einzudringen, indem sie Zellmembranverzerrungen und -zerstörung hervorrufen, was zum Zelltod von Mikroben führt. Joshi et al. biosynthetisierte MnO2-NPs unter Verwendung von Pflanzenextrakt (Blattextrakt von Datura stramonium als Reduktionsmittel), dann wurden 10 mg/ml MnONPs gegen menschliche Krankheitserreger getestet und festgestellt, dass sie wirksame antagonistische Wirkungen zeigten (30–44 mm)24. Zur Biosynthese von ZnO-, MnO2- und MgO-NPs verwendeten Ogunyemi et al. rhizosphärische Bakterien (Paenibacillus polymyxa Stamm Sx3). Ihre Studien ergaben signifikante Hemmwirkungen (13–17 mm) bei einer Konzentration von 16,0 µg/ml gegen phytopathogene Bakterien (Xanthomonas oryzaepv.oryzae)6. Laut dieser Studie steigert die Anwendung auf Reispflanzen auch die Pflanzenwachstumsfaktoren und die Biomasse und verringert gleichzeitig die Expression der bakteriellen Blattfäulekrankheit bei Reis. Daher sind diese metallischen Nanopartikel in geringen Dosen ungiftig, biologisch sicher und biokompatibel. Schließlich muss die Feldanwendung mykosynthetisierter MnO-NPs als potenzielles Pestizid in der Landwirtschaft bisher noch gründlich untersucht werden.

In dieser Studie wurden biologisch synthetisierte stäbchenförmige, mykosynthetisierte MnO-NPs mit einer durchschnittlichen Kristallitgröße von ~ 35 nm unter Verwendung von MnCl2.4H2O (Vorläufer) und Extrakt des endophytischen Trichoderma virens-Stammes EG92 (Reduktions-, Stabilisierungs- und Verkappungsmittel) gebildet, die kultiviert wurden in Weizenkleiemedium. Mehrere statistische Optimierungsansätze (Placket-Burman- und Box-Behnken-Designs) wurden verwendet, um das höchste Massengewicht der Pilzzellen zu erreichen. Da das Placket-Burman-Design verwendet wurde, um die Haupteinflüsse auf die Produktion von Pilzbiomasse zu untersuchen. Die Korrelationen zwischen den wichtigen Parametern und dem produzierten Pilzbiomassegewicht wurden dann mithilfe eines faktoriellen Box-Behnken-Designs korreliert. Die Ausbeuten an EG92-Zellen und MnO-NPs wurden dann industriell gesteigert, indem ein untergetauchter Fermentations-Batch-Modus mit einstellbaren Belüftungs-/Rührraten verwendet wurde, gefolgt von einem Fed-Batch-Fermentationsmodus mit einem exponentiell gepulsten Zufuhrsystem. Nach 48 Stunden ergab diese industrielle Produktionslinie Xmax (295,36 g/l) und Pmax (217,95 g/l). Die Ausbeute an MnO-NPs wurde mithilfe des Taguchi-Designs um das 40-fache (395,36 g/l) gegenüber den Ausgangsbedingungen erhöht, um die Herstellungsreaktion zu verbessern. Diese Ergebnisse sind insofern einzigartig, als sie die Produktion von endophytischer Trichoderma-Biomasse und damit die Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung von Abfallmaterial maximieren, was noch nie zuvor durchgeführt wurde. Ein derartiges Maß an Trockenmasse-Biomasse und MnO-NPs-Ertragsproduktivität wurde noch nie zuvor gesehen. Die antagonistischen Aktivitäten gegen Phytopathogene wurden untersucht, wobei Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34) die höchsten Hemmzonen aufwies, gefolgt von Alternaria alternate (42,75 ± 3,96). Darüber hinaus variierten die MBC-Werte für Bakterienzellen zwischen 200 und 280 µg/ml, während die MFC-Werte für phytopathogene Pilzzellen zwischen 340 und 440 µg/ml lagen. Schließlich sind diese mykosynthetisierten MnO-NPs in niedrigen Dosen ungiftig, biologisch sicher und biokompatibel. Dadurch könnte es als Nano-Bio-Pestizid in der Landwirtschaft eingesetzt werden.

Gesunde Blätter der ägyptischen schwarzen Aubergine (Solanum melongena L.) wurden auf der Versuchsfarm der Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen (SRTA-City), New Borg El-Arab City, Alexandria, Ägypten, gesammelt. Die getesteten phytopathogenen Pilze (Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Helminthosporium sp., Alternaria alternative, Aspergillus flavus, Aspergillus niger und Phytophthora arenaria) und Bakterien (Clavibacter michiganensis, Erwinia carotovora, Acetobacter pasteurianus, Erwinia amylovora und Erwinia persicina) wurden gesammelt vom Department of Bioprocess Development, GEBRI, SRTA-City, Ägypten und Zagazig University, Fakultät für Landwirtschaft, El-Sharkia, Ägypten.

Pflanzenblätter wurden dreimal mit Leitungswasser gewaschen, dann nacheinander 5 Minuten lang in 70 %iges Ethanol und 2 Minuten lang in 99 %iges Ethanol getaucht, und die Blätter wurden schließlich in einer 6 %igen Sterilisationslösung eingeweicht, bestehend aus (10 % NaHCO3: 0,1 % Tween). -20) für 2 Min. Die sterilisierten Blätter wurden mehrmals mit sterilisiertem destilliertem Wasser gewaschen und in einem Laminar-Flow-Schrank33 trocknen gelassen. Das letzte Spülwasser wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA) ausgebreitet, die 200 g Kartoffeln, 20 g Dextrose und 20 g Agar enthielten, um den Sterilisationsschritt zu testen. Diese sterilisierten Blätter wurden mit einer sterilen Skalpellklinge geschnitten und zermahlen und in einem Mörser zerstoßen. Unter Verwendung der seriellen Verdünnungsmethode wurden 100 µl des verdünnten Blattextrakts hergestellt, auf PDA-Platten verteilt und drei Wochen lang bei 30 °C inkubiert. Entophytische Pilze wurden mithilfe von PDA-Platten ausgewählt und gereinigt. Schließlich wurden die gereinigten entophytischen Pilze unter Verwendung eines MGYP-Brühemediums gezüchtet, das aus 0,3 % Malzextrakt, 1 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt und 0,5 % Pepton bestand, und der endgültige pH-Wert wurde auf 5,9 eingestellt. Anschließend wurden diese Kulturen 72 Stunden lang bei 30 °C unter Schüttelbedingungen (150 U/min) inkubiert.

MnO-NPs wurden unter Verwendung von MnCl2·4H2O als Ausgangsverbindung (Vorläufer) und dem Pilzextrakt als Reduktions-, Stabilisierungs- und Verkappungsmittel biosynthetisiert. MnO-NPs wurden synthetisiert, indem 100 ml eines Pilzextrakts mit 100 ml 1 M MnCl2.4H2O gemischt und anschließend 2 Stunden lang kontinuierlich bei 60 °C gerührt wurden (Inkubation 1). Die Reaktionsfarbe ändert sich aufgrund der Mn-Ionen-Reduktion von gelb nach gelblich-braun. Die überschüssige Menge an Pilzextrakt (50 ml) wurde zu den produzierten MnO-NPs gegeben und unter Rührbedingungen (200 U/min) bei Raumtemperatur (28 °C) 5 Stunden lang inkubiert (Inkubation 2). Anschließend ändert sich die Reaktionsfarbe aufgrund der Capping-Phase von gelblich-braun nach rotbraun (was mit bloßem Auge leicht zu erkennen ist)6,27. Schließlich wurden die durch Pilze synthetisierten MnO-NPs 20 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert und dreimal mit destilliertem Wasser und Ethanol gewaschen. Anschließend wurde der braune Rückstand 24 Stunden lang in einem Ofen bei 50 °C getrocknet. Ein Mörser und ein Stößel wurden verwendet, um die MnO-NPs zu einem geschätzten feinen Pulver (g/l) zu zerkleinern und in verschlossenen Fläschchen aufzubewahren. Mithilfe der Welldiffusionsmethode schätzten phytopathogene Pilze und Bakterien die antiphytopathogene Aktivität biosynthetisierter MnO-NPs.

UV-sichtbare Absorptionsspektren von aus Pilzen hergestellten MnO-NPs wurden mit einem Shimadzu UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu, Tokio, Japan) gemessen. Die FTIR-Spektrenanalyse für extrazelluläre Pilzfraktionen und durch Pilze hergestellte MnO-NPs wurde auf (Shimadzu FTIR-8400 S, Japan) im Spektralbereich von 4000–400 cm-1 aufgezeichnet. SEM: Die morphologische Struktur von MnO-NPs wurde durch Rasterelektronenmikroskop-Untersuchung (REM) unter Verwendung eines (JEOL JSM 6360LA, Japan) mit seiner kombinierten EDX-Einheit nachgewiesen. Die thermische Stabilität von aus Pilzen hergestellten MnO-NPs wurde mithilfe des thermogravimetrischen Analysemodells (TGA) (TGA/DSC, Shimadzu, Japan) mit einer Heizrate von 20 °C/min unter Stickstoffstrom bestimmt. Röntgenbeugungsmuster (XRD) wurden mit (Shimadzu 7000 Diffraktometer, Japan) erhalten, wobei mit CuKα-Strahlung (λ = 0,15406 nm) gearbeitet wurde, die bei 30 kV und 30 mA mit einer Scanrate von 2°/min für 2θ-Werte zwischen 20 erzeugt wurde und 80 °C. Die durchschnittliche Kristallgröße wurde mithilfe der Scherrer-Formel geschätzt, wie in Gl. (1); Dabei ist Y die Kristallgröße der durch Pilze hergestellten MnO-NPs, λ die Wellenlänge der CuKα-Strahlung, β die Halbmaxima der verschiedenen Peaks in voller Breite und θ der halbe Beugungswinkel.

Unter fünf isolierten endophytischen Pilzen wurde ein Isolat mit hoher Häufigkeit der Produktion von durch Pilze hergestellten MnO-NPs, die über wirksame antiphytopathogene Aktivitäten verfügen, für weitere Untersuchungen ausgewählt. Um den ribosomalen internen transkribierten Spacer (ITS) zu bestimmen, wurde das Pilzgenom extrahiert und unter Verwendung des Minipreps DNA Kit gereinigt, das von (Promega, USA) bezogen wurde. Die ITS-Region wurde mittels PCR mit 10 pmol ITS1-Primer (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) und 10 pmol ITS4-Primer (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) amplifiziert. Diese Reaktion wurde durch Mischen von 100 mg Pilz-DNA, jeweils 2,5 mM dNTP und 1,5 mM MgCl2 mit 0,4 μl 500 U Taq-DNA-Polymerase42 eingeleitet. Die anfängliche Denaturierungstemperatur betrug 95 °C und wurde auf 5 Minuten verlängert, und die letzte Verlängerung wurde auf 10 Minuten bei 72 °C verlängert. PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese aufgetrennt und mit einem UV-Transilluminator betrachtet. Gemäß der elektrophoretischen Migration wurden die interessierten PCR-Produkte mithilfe von Silica-Spin-Säulen (DNA Clean & Concentrator, Zymo Research) aus dem Gel eluiert. Das gereinigte PCR-Produkt wurde direkt gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll sequenziert (Modell 3130 automatisierter DNA-Sequenzer, Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Hitachi, Japan). Die Sequenz wurde mit den homologen Sequenzen unter Verwendung von NCBI BLAST verglichen, das unter http://www.ncbinlmnih.gov/ verfügbar ist. Das Alignment mehrerer Sequenzen wurde mit der BioEdit-Software (Hall, 1999) durchgeführt und ein phylogenetischer Baum wurde mit der Neighbor-Joining-Methode (NJ) über ein MEGA6-Programm erstellt.

Die extrahierten bioaktiven Metaboliten wurden als Reduktions-, Verkappungs- und Stabilisierungsmittel bei der Herstellung von MnO-NPs verwendet. Daher wurden extrazelluläre und zytoplasmatische Fraktionen extrahiert, um das kompetente Pilzzellkompartiment zu ermitteln, das die höchsten MnO-NP-Mengen produzierte. Die vergleichende Bewertungsstrategie für Pilzkultivierungsmedien, die die meisten Metaboliten produzierten, wurde ebenfalls untersucht. Zunächst wurden die verwendeten Wachstumsmedien wie an anderer Stelle angegeben43,44,45 ausgewählt, wie in (Tabelle 1S, Ergänzende Materialien) gezeigt. Alle getesteten Medien (50 ml) wurden in 250-ml-Kolben zubereitet und separat 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Im Fall von Weizenkleiemedium (WBM) wurde Weizenkleieextrakt (WBE) hergestellt, indem 10 g ofengetrocknete Weizenkleie mit 90 ml destilliertem Wasser bei 60 °C 5 Stunden lang gemischt und dann bei 100 °C inkubiert wurden 1 Std. Anschließend wurden die extrahierten Nährstoffe durch ein Filtersystem bei einem einstellbaren pH-Wert von 7,046 abgetrennt. Dieses Filtrat wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt und separat 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Alle sterilisierten Medien wurden mit Pilzinokulum (5 %, Vol./Vol.) beimpft und 48 Stunden lang bei 28 °C (150 U/min) kultiviert. Ein Ultrafiltrationssystem sammelte die Pilzbiomasse, um eine extrazelluläre Fraktion herzustellen. Die zytoplasmatische Fraktion wurde extrahiert, indem die gesammelte Pilzbiomasse in 50 mM PBS (pH 7,0) suspendiert und dann 25–30 Mal bei 40–50 % Beschallung beschallt wurde. Abschließend wurden die erhaltenen Fraktionen 20 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert und dann in sauberen Glasschraubflaschen bei 4 °C gelagert. Der Gesamtprotein- und Kohlenhydratgehalt aller Fraktionen wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Protein-Assay-Kits und eines kolorimetrischen Kohlenhydrat-Assay-Kits von Commercial-Rad (Milpitas, CA 95035 USA) bestimmt. Die phytochemische Analyse (Gehalt an Alkaloiden, Flavonoiden, Tanninen, Phenolen, Steroiden, Saponinen und Terpenoiden) wurde in Vergleichsstudien ermittelt, um den geeigneten Zellanteil zu bestimmen, der als reduzierende, begrenzende und stabilisierende Mittel fungierte21. Schließlich wurde die Herstellung von MnO-NPs-Reaktionen wie zuvor beschrieben durchgeführt, um deren Trockengewicht in den Vergleichsstudien zu verwenden.

Die verwendete Bioverarbeitungsstrategie begann mit der Entwicklung wirksamer Bedingungen für die Extraktion löslicher Nährstoffe aus Weizenkleiepulver. Da die Extraktionsmethode die Menge der aus Weizenkleie extrahierten Kohlenhydrate, Proteine, Aminosäuren und anderen Spurenelemente beeinflusste. Es gibt also viele Faktoren wie Weizenkleiepulver (50, 100 und 150 g/l), Extraktionszeit (3, 12 und 24 Stunden), pH-Wert (6, 7 und 8) und Extraktionstemperatur (30, 50 und 70 °C) wurden in diesen Experimenten untersucht. Zweitens wurden die Inhaltsstoffe des gesamten Mediums und die Pilzwachstumsbedingungen, die sich auf die Biomasseproduktion auswirken, optimiert. Dementsprechend wurden aufeinanderfolgende statistische Optimierungsansätze (Plackett-Burman- und Box-Behnken-Designs) angewendet, um das höchste Massengewicht der Pilzzellen zu erzielen. Da das Plackett-Burman-Design verwendet wurde, um die wesentlichen Faktoren zu untersuchen, die die Produktion von Pilzbiomasse beeinflussen. Anschließend wurde das faktorielle Box-Behnken-Design angewendet, um die Beziehungen zwischen den signifikanten Faktoren und dem produzierten Pilzbiomassegewicht zu korrelieren.

Dieses experimentelle Design wurde verwendet, um die Produktion von Pilzbiomasse zu optimieren, indem die Wirkung verschiedener Kultivierungsvariablen untersucht wurde. Für diese Studie bestand die verwendete Matrix aus 12 Experimenten (Trails) und 9 unabhängigen Variablen (Alter des Inokulums, Bewegung, pH-Wert, CuSO4, Inkubationstemperatur, WBE (%), Glucose, Größe des Inokulums und MgSO4), von denen jede eine hat niedriger Pegel (−) und hoher Pegel (+). Alle Versuche wurden dreifach durchgeführt, um die signifikanten Variablen zu ermitteln, und die Mittelwerte der Pilzbiomasseproduktion (Reaktion) wurden berechnet. Die endgültigen Daten wurden statistisch analysiert, um den p-Wert und die Konfidenzniveaus mithilfe einer Standard-Regressionsanalyse zu bestimmen. Anschließend wurde die Polynommodellgleichung erster Ordnung (Gleichung 2) durch einen F-Test angewendet, wobei Y die Antwort, βo der Schnittpunkt des Modells, βi die Variablenschätzung und Xi die Variable ist37,47. Darüber hinaus wurde die Wirkung jedes Faktors anhand von Gleichung bestimmt. (3); Dabei ist E(x) die Pilzbiomasseproduktion, N die Anzahl der Spuren, M+ und M- die Auswirkung dieses Faktors auf ihren Ebenen.

Ein dreistufiges Design ist eine leistungsstarke statistische Methode zur Optimierung des mikrobiellen Fermentationsprozesses durch Untersuchung des Zusammenspiels wichtiger Faktoren bei der Biomasseproduktion. Die ausgewählten drei unabhängigen Parameter (pH, WBE und Inokulumgröße) wurden auf drei Ebenen getestet, codiert mit –, 0, + für niedrige, mittlere bzw. hohe Werte, um den idealen Punkt für die maximale Biomasseproduktion zu berechnen und abzuschätzen. Die Antwortvariable wurde mithilfe eines Polynommodells zweiter Ordnung (Gleichung 4) angepasst, um die abhängige Antwort mithilfe der Software Minitab 18.1 mit unabhängigen Variablen zu korrelieren. Die Qualität der Anpassung der Polynommodellgleichung wurde durch den Koeffizienten R239,40 ausgedrückt. Die tatsächlichen Werte jedes Faktors wurden mithilfe der Myers- und Montgomery-Gleichung (Gleichung 5) bestimmt. Dabei ist Y die vorhergesagte Reaktion, βo der Achsenabschnitt, βi der lineare Koeffizient, βij der quadratische Koeffizient, βii die lineare Interaktion zwischen Xi und Xj die Regressionskoeffizienten und XiXj sind Eingabevariablen, die die Antwortvariable beeinflussen Y37.

Der getestete Pilzstamm wurde zunächst auf Kartoffel-Dextrose-Agarplatten inokuliert und 14 Tage lang bei 30 °C unter statischen Bedingungen inkubiert. Anschließend wurde die Sporensuspension unter aseptischen Bedingungen mit einer sterilen Kochsalzlösung (0,9 %) hergestellt. Diese Pilzsporen wurden mittels Hämozytometer gezählt, um eine geeignete Sporensuspension für den Inokulationsschritt herzustellen. Die Nachkultivierung wurde vorbereitet, indem 500 ml statistisch optimiertes Medium in Schüttelflaschen (1000 ml) mit 0,5 ml frisch zubereiteter Pilzsporensuspension (3 × 104 Sporen/ml) beimpft und bei 30 °C inkubiert wurde. Schließlich wurde ein 7 l BioFlo 310-Bioreaktor (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) mit 4,5 l des sterilen Mediums beimpft, dann wurden die Temperatur und der pH-Wert auf 30 °C bzw. 5,5 eingestellt. Die Mischungscharakteristik der Belüftungs-/Rührraten und der Zeitpunkt wurden unter Verwendung von Pilzbiomasse und MnO-NP-Produktion als Reaktionen über sieben Kontrollstrategien im Batch-Fermentationsmodus untersucht. Die getesteten Strategien wurden wie in Tabelle 10 beschrieben entworfen. Während der Fermentationsperioden wurden Proben entnommen, um die Biomasse- und MnO-NP-Produktion zu berechnen.

Der Endpunkt der Fermentationsperiode wurde durch die Erhöhung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) ermittelt, was auf die Erschöpfung der Kohlenstoffquelle hinweist48,49. Zu diesem Zeitpunkt wurden die vier Fütterungsstrategien mit unterschiedlichen Fed-Batch-Fermentationsmodi getestet. Die getesteten vier Fed-Batch-Strategien wurden nur mit den Zutaten des gesamten optimierten Mediums oder WBE, wie in Tabelle 11 beschrieben, eingerichtet. Die Luftstromrate und die Rührgeschwindigkeit wurden so gesteuert, dass der DO-Gehalt in allen getesteten Fed-Batch-Fermentationsmodi nicht unter 10 % fiel. In der logarithmischen Phase nimmt die Zellmasse des Pilzes mit der Zeit exponentiell zu. Während das Verhalten des Pilzwachstums und der produzierten MnO-NPs über verschiedene Fermentationsmodelle unter Verwendung unterschiedlicher Gleichungen beschrieben und kinetisch bestimmt wurden30,32. Der Ertragskoeffizient wurde anhand der verbrauchten Kohlenstoffquelle und der erzeugten Biomasse bestimmt. Daher wurden viele Parameter wie der Biomasseertragskoeffizient (YX/S), die maximale Biomasse (Xmax), der maximale MnO-NP-Ertrag (Pmax) und die maximale spezifische Wachstumsrate (µmax) berechnet.

Die Biosynthesereaktion von MnO-NPs wurde durch verschiedene Inhaltsstoffe und Reaktionsbedingungen beeinflusst, wie z. B. die Vorläuferkonzentration (Grundmetall), die Konzentration des Pilzextrakts (Reduktions-/Verkappungsmittel), den pH-Wert, die Inkubationstemperatur, die Inkubationszeit (Reaktionszeit) und das Stabilisierungsmittel (Pilzextrakt). ). Das Taguchi-Design wurde angewendet, um die Produktion von MnO-NPs durch die effizienten biologischen Herstellungsschritte dieser Optimierungsstrategie zu maximieren. Daher wurde in diesen Experimenten das L25-Taguchi-Orthogonal-Array-Design (5**6) zur Durchführung dieser Optimierungsstrategie ausgewählt, während die Software MINITAB 18 und die Gleichungen verwendet wurden. (6–9), wobei das Massengewicht der aus Pilzen hergestellten MnO-NPs bestimmt und die maximalen Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N) für jede Herstellungsreaktion berechnet wurden. Schließlich wurde der Validierungstest auf der Grundlage der Ergebnisse von Taguchi durchgeführt und die vorhergesagten S/N-Verhältnisse berechnet.

Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von durch Pilze hergestellten MnO-NPs wurde aufgezeichnet und berechnet. Außerdem wurden antagonistische Aktivitäten von aus Pilzen hergestellten MnO-NPs gegen Phytopathogene (Bakterien und Pilze) beobachtet und mithilfe einer Welldiffusionsmethode bestimmt23. Da phytopathogene Pilze in Czapek-Medium kultiviert wurden, enthielt dieses (g/l): NaNO3, 3,0; K2HPO4, 1,0; MgSO4∙7H2O, 0,5; KCl, 0,5; FeSO4∙7H2O, 0,01; und Agar, 15 (pH 4,8). Darüber hinaus wurden phytopathogene Bakterien in ein Nähragarmedium geimpft, das aus (g/l) bestand: [Pepton 5, Natriumchlorid 5, Rindfleischextrakt 1,5, Hefeextrakt 1,5 und Agar 15 (pH 7,0)]. Verschiedene Konzentrationen von durch Pilze hergestellten MnO-NPs (10, 50, 90, 130, 170, 210, 250, 290, 330 und 370 µg/ml) wurden hergestellt und in Vertiefungen (0,5 mm) geladen. Anschließend wurden diese Platten 24–72 Stunden lang bei 30 °C inkubiert und auf Hemmzonen untersucht. Abschließend wurden die maximale bakterizide Konzentration (MBC) und die maximale fungizide Konzentration (MFC) überprüft und bestimmt50. Diese Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und diese Daten wurden mithilfe der einfaktoriellen ANOVA mit der Minitab-Software statistisch analysiert.

Der Artikel enthält die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse einer Studie verwendet werden. Die Autoren stellen klar, dass keine weiteren Genehmigungen erforderlich waren, um Forschung an Pflanzenmaterial gemäß den lokalen und institutionellen Richtlinien durchzuführen. Dieses Isolat wurde in der GenBank-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF429775) als endophytischer Trichoderma virens-Stamm EG92 mit der Zugangsnummer MF429775 eingereicht, da es Trichoderma virens völlig ähnlich war.

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Sie schlug die Idee und das Konzept für die Forschung vor, entwarf einen Forschungsplan, führte die meisten Experimente durch, sammelte Daten, analysierte, verfasste/bearbeitete das Original und überprüfte das Manuskript. ISY: Datenanalyse und Beratung. HYZ: Datenanalyse, Beratung, Überarbeitung des endgültigen Manuskripts; und EAK: Datenanalyse, Dateninterpretation und Verfassen/Bearbeiten des Original- und Endmanuskripts. Das endgültige Manuskript wurde von allen Autoren verfasst, überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Shahira H. EL-Moslamy oder Elbadawy A. Kamoun.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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EL-Moslamy, SH, Yahia, IS, Zahran, HY et al. Neuartige Biosynthese von MnO-NPs unter Verwendung von Mycoendophyten: industrielle Bioverarbeitungsstrategien und Steigerung der Produktion mit ihrer Bewertung als antiphytopathogene Mittel. Sci Rep 13, 2052 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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Eingegangen: 16. Mai 2022

Angenommen: 24. Januar 2023

Veröffentlicht: 04. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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