Zwei Geruchsrezeptoren regulieren 1 | Beijing AgileLift Ventures Group Co., Ltd

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 176 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die orientalische Fruchtfliege Bactrocera dorsalis (Hendel) ist ein berüchtigter Schädling von Obstkulturen. Trächtige Weibchen finden geeignete Orte zur Eiablage, indem sie flüchtige Bestandteile der Wirtspflanze erkennen. Hier zeigen wir, dass 1-Octen-3-ol, ein flüchtiger Stoff aus der Mango, das Eiablageverhalten weiblicher Fliegen steuert. Zwei Geruchsrezeptoren (BdorOR7a-6 und BdorOR13a) wurden durch qPCR-Analyse, heterologe Expression in Xenopus laevis-Oozyten und HEK 293-Zellen, gefolgt von In-vitro-Bindungstests sowie CRISPR/ als Schlüsselrezeptoren für die Wahrnehmung von 1-Octen-3-ol identifiziert. Cas9-Genombearbeitung in B. dorsalis. Molekulares Docking und ortsspezifische Mutagenese werden verwendet, um die Hauptbindungsstellen für 1-Octen-3-ol zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen das Potenzial von 1-Octen-3-ol, trächtige Weibchen anzulocken, und den molekularen Mechanismus seiner Wahrnehmung bei B. dorsalis. BdorOR7a-6 und BdorOR13a können daher als molekulare Ziele für die Entwicklung weiblicher Lockstoffe verwendet werden. Darüber hinaus werden unsere ortsspezifischen Mutagenesedaten die chemische Entwicklung von 1-Octen-3-ol erleichtern, um effizientere Lockstoffe zu erzeugen.

Die Auswahl geeigneter Eiablagestellen durch pflanzenfressende Insekten spiegelt normalerweise die Fähigkeit trächtiger Weibchen wider, flüchtige Stoffe zu erkennen, die von bevorzugten Wirtspflanzen freigesetzt werden. Beispiele hierfür sind die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die Terpene erkennt, die von fermentierenden Früchten freigesetzt werden1,2, die Bohnensamenfliege Delia platura, die 1-Octen-3-ol und 3-Octanon erkennt, die von keimenden Samen freigesetzt werden3, und der Seidenspinner Bombyx mori, der erkennt flüchtige Stoffe, die von Maulbeerblättern freigesetzt werden4, und die Schlupfwespe Anastatus japonicas, die β-Caryophyllen, α-Farnesen und cis-3-Hexen-ol erkennt, die von Wirtspflanzen und Insekten freigesetzt werden5. Die orientalische Fruchtfliege Bactrocera dorsalis (Hendel), einer der zerstörerischsten und invasivsten Schädlinge von Obstkulturen6, legt Eier am liebsten auf vollreife Mangofrüchte7,8,9,10. Es wird angenommen, dass dies die Anziehungskraft trächtiger Weibchen auf die flüchtigen Stoffe widerspiegelt. Die Chemikalie 1-Octen-3-ol, ein flüchtiger Stoff aus der Mangofrucht, wurde als einer der möglichen Orientierungshilfen für die Wahl des Eiablageortes bei dieser Fliege angesehen11,12.

Das Geruchssystem von Insekten spielt eine wichtige Rolle bei der Verwendung flüchtiger Stoffe zur Steuerung des Eiablageverhaltens13,14,15. Die Geruchsrezeptoren (ORs), die für die Wahrnehmung spezifischer flüchtiger Stoffe verantwortlich sind, können mithilfe einer Kombination aus expositionsbasierten Verhaltenstests und Funktionsverlustmutationen mit direkten Bindungstests und ortsgerichteter Mutagenese als Strategie zur Identifizierung spezifischer Bindungsstellen bestimmt werden16 . Nach der Charakterisierung der flüchtigen Stoffe und ihrer Rezeptoren kann die umgekehrte chemische Ökologie zur Entwicklung neuartiger Lockstoffe genutzt werden, die auf wichtige ORs effizienter abzielen13,17,18,19. Beispielsweise wurde festgestellt, dass DmelOR19a für die Wahrnehmung von Zitrusterpenen verantwortlich ist, die das Eiablageverhalten bei D. melanogaster2 steuern. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass HassOR31 das Eiablageverhalten von Helicoverpa assulta als Reaktion auf von Wirtspflanzen freigesetztes Z-3-Hexenylbutyrat steuert13. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Löschung des olfaktorischen Rezeptor-koexprimierten Rezeptor-Gens (BdorOrco) mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems die 1-Octen-3-ol-induzierte Eiablagepräferenz bei weiblichen B. dorsalis aufhob20. Die vorherige Studie hat auch direkt gezeigt, dass BdorOR13a in vitro an 1-Octen-3-ol bindet16, es wurden jedoch bisher keine In-vivo-Verhaltensdaten vorgelegt. Eine weitere Analyse der Wahrnehmung von 1-Octen-3-ol in B. dorsalis wurde durch einen unvollständigen OR-Datensatz aufgrund des Fehlens einer qualitativ hochwertigen Genomsequenz behindert.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir die B. dorsalis OR-Familie mithilfe einer neuen, hochwertigen Genomassemblierung umfassend annotiert. Wir haben zwei ORs identifiziert, die möglicherweise an der Reaktion auf 1-Octen-3-ol beteiligt sind, indem wir die Expressionsanalyse von ORs bei jungfräulichen und begatteten Weibchen durchgeführt und Kandidaten-ORs mit heterologen Expressionssystemen getestet haben, gefolgt von Spannungsklemmenaufzeichnung und Calcium-Imaging-Assays. Darüber hinaus wurden diese beiden Gene mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems ausgeschaltet. Wir verwendeten Bindungsstellenanalyse und ortsspezifische Mutagenese, um den Bindungsmechanismus zu bestimmen. Wir verglichen auch die Wirkung von 1-Octen-3-ol auf schwangere und jungfräuliche Frauen. Unsere Ergebnisse weisen auf den molekularen Mechanismus der 1-Octen-3-ol-Wahrnehmung in B. dorsalis hin und liefern molekulare Ziele für die Entwicklung effizienterer weiblicher Lockstoffe auf der Grundlage der chemischen Verfahrenstechnik von 1-Octen-3-ol.

Wir verglichen die Fähigkeit von vollreifem Mangofleisch und 1-Octen-3-ol, jungfräuliche und begattete weibliche B. dorsalis mithilfe von Fallenködern anzulocken. Das vollreife Mangofruchtfleisch (Abb. 1a) und das 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol (verdünnt mit Mineralöl (MO)) (Abb. 1b) waren beide deutlich attraktiver für 15-Tage- alte begattete Weibchen als 15 Tage alte jungfräuliche Weibchen und 3 Tage alte unreife Weibchen, es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den jungfräulichen und unreifen Weibchen. Darüber hinaus stieg der Präferenzindex (die Anzahl der Fliegen in der Duftstofffalle abzüglich der Anzahl der Fliegen in der MO-Falle und dann dividiert durch die Gesamtzahl der eingeführten Fliegen) trächtiger Weibchen gegenüber reifer Mango und 1-Octen-3-ol mit der Zeit an. Fast alle Weibchen trafen ihre Wahl nach ca. 8 Stunden und blieben danach relativ stabil.

a Der Präferenzindex von Mangofleisch für 3 Tage alte unreife Weibchen, 15 Tage alte jungfräuliche Weibchen und 15 Tage alte begattete Weibchen. b Der Präferenzindex von 1-Octen-3-ol für 3 Tage alte unreife Weibchen, 15 Tage alte jungfräuliche Weibchen und 15 Tage alte begattete Weibchen. c Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für Tests zum Eiablageverhalten. d–g Durch Mango und/oder 1-Octen-3-ol induziertes Eiablageverhalten. Die Heatmap basiert auf Flugspuren, die mit der EnthoVision XT-Software überwacht werden. Das Farbschema stellt die Spurendichte und die verbrachte Zeit von acht Weibchen dar, wobei Rot die höchste Dichte anzeigt. Die Bilder zeigen das Ausmaß der Eiablage nach 24 Stunden. Die Histogramme zeigen die durchschnittliche Anzahl der von jedem Weibchen gelegten Eier. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SE von n ≥ 7 biologischen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Student-t-Tests bestimmt (***p < 0,001). d Mangofleisch vs. MO. e 1-Octen-3-ol vs. MO. f Mangofleisch vs. 1-Octen-3-ol. g Mangofleisch + 1-Octen-3-ol vs. Mangofleisch + MO.

Wir haben die Wirkung von reifer Mango und 1-Octen-3-ol auf das Eiablageverhalten mithilfe des in Abb. 1c gezeigten experimentellen Ansatzes untersucht. Kurz gesagt, wir haben ca. 60 mg Mangofleisch oder 20 µL 1-Octen-3-ol-Lösung auf eine Seite einer Petrischale (Punkt L) und 20 µL MO auf die gegenüberliegende Seite (Punkt R) gegeben und dann verfolgt fliegt. Wenn Mangofleisch an Punkt L und MO an Punkt R platziert wurde, betrug die durchschnittliche Anzahl der von jedem Weibchen gelegten Eier 27 ± 8 (n = 7) an Punkt L und nahezu Null an Punkt R (p < 0,001, Student-t-Test). und die Fliegenspuren konzentrierten sich hauptsächlich um das Fruchtfleisch der Mango (Abb. 1d). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn 1-Octen-3-ol am Punkt L und MO am Punkt R aufgetragen wurde (Abb. 1e). Als Mangofleisch direkt gegen 1-Octen-3-ol getestet wurde, legten die Fliegen deutlich mehr Eier im 1-Octen-3-ol-Bereich (Abb. 1f). Darüber hinaus zeigten trächtige Weibchen eine Vorliebe für mit 1-Octen-3-ol angereichertes Mangofleisch im Vergleich zu mit MO angereichertem Mangofleisch, und die Anzahl der Eier war im Vergleich zu Mangofleisch oder 1-Octen-3-ol allein höher (Abb. 1g). Die Spuren der Fliegen konzentrierten sich in allen Experimenten um die bevorzugte Eiablagestelle. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 1-Octen-3-ol als Köder zur Bekämpfung von B. dorsalis-Weibchen geeignet sein könnte. Das Eiablageverhalten wird in den Zusatzfilmen 1–4 detaillierter dargestellt.

Wir identifizierten 74 OR-Gene von B. dorsalis mithilfe von BLASTX, um genomische Contigs von B. dorsalis anhand der Aminosäuresequenzen und Pfam-Domänen bekannter ORs von D. melanogaster mit einem Identitäts-Cut-off von 30 % zu screenen (Ergänzungstabelle 1, Ergänzende Daten 1). . Die Contigs wurden aus einer hochwertigen endgültigen Genomassemblierung von B. dorsalis abgeleitet, die bei CNGBdb eingereicht wurde (Zugangsnummer CNP0003192). Wir haben auch mehrere B. dorsalis-Gewebetranskriptome einbezogen, darunter Antenne (GenBank SRR9026238), Oberkieferpalpen und Rüssel (Zugangsnummer CNP0003333) und andere Gewebe (Zugangsnummer CNP0003334). Wir haben eine BLASTN-Suche verwendet, um die kodierenden Sequenzen von ORs in voller Länge vorherzusagen, und ihre Sequenzen durch RT-PCR bestimmt. Eine Homologiesuche basierend auf den Aminosäuresequenzen von D. melanogaster-ORs ergab mehrere homologe Gene für mehrere ORs, einschließlich BdorOR7a, BdorOR33b, BdorOR59a, BdorOR63a, BdorOR67d und BdorOR94a, wohingegen die entsprechenden Drosophila-ORs nur ein Gen haben (ergänzende Abbildung 1). .

Die Expressionsprofile von B. dorsalis-OR-Genen wurden untersucht, indem sieben Gewebe in verschiedenen B. dorsalis-Körpersegmenten mittels qPCR getestet wurden (ergänzende Abbildung 2). Die meisten Gene wurden in sensillenreichen Geweben wie den Oberkieferpalpen, der Kopfkutikula und insbesondere den Antennen stark exprimiert. Mehrere Gene wurden auch im Rüssel exprimiert, darunter BdorOR7a-4, BdorOR19a, BdorOR24a, BdorOR47b und BdorOR94a-2. Wir verglichen die Genexpressionsprofile bei 15 Tage alten jungfräulichen und verpaarten Weibchen und zeigten 20 Gene, die signifikant hochreguliert waren, und fünf Gene, die nach der Paarung signifikant herunterreguliert waren (ergänzende Abbildung 3). Da die schwangeren Weibchen empfindlicher auf 1-Octen-3-ol reagierten, betrachteten wir die 20 hochregulierten OR-Gene als Kandidaten für die Analyse der 1-Octen-3-ol-Bindungsaffinität.

Um zu bestimmen, welche B. dorsalis-ORs hauptsächlich für die Wahrnehmung von 1-Octen-3-ol verantwortlich sind, haben wir alle 20 Kandidaten zusammen mit dem Co-Rezeptor-Gen BdorOrco in Xenopus laevis-Oozyten exprimiert und dazu ein Zwei-Elektroden-Spannungsklemmsystem verwendet Zeichnen Sie die Reaktion auf 1-Octen-3-ol auf. Mit Wasser injizierte Kontroll-Oozyten erzeugten keine nachweisbaren Ströme, wenn sie entweder DMSO oder 1-Octen-3-ol ausgesetzt wurden (Abb. 2a). Unter den 20 Kandidaten-ORs wurden nur Eizellen, die BdorOR7a-6/BdorOrco oder BdorOR13a/BdorOrco exprimierten, eindeutig durch 1-Octen-3-ol aktiviert, und in beiden Fällen beobachteten wir dosisabhängige Ströme (Abb. 2b, c). Die halbmaximale wirksame Konzentration (EC50-Wert) von 1-Octen-3-ol, die eine Reaktion auf halbem Weg zwischen der Grundlinie und dem Maximum hervorruft, betrug 105 μM für BdorOR7a-6/BdorOrco und 1,268 μM für BdorOR13a/BdorOrco. BdorOR13a scheint daher eine viel größere Affinität zu 1-Octen-3-ol zu haben als BdorOR7a-6.

a–c Reaktionen auf 1-Octen-3-ol von Xenopus-Oozyten, die BdorOR7a-6/BdorOrco oder BdorOR13a/BdorOrco koexprimieren. a Xenopus-Oozyten wurden mit den entsprechenden Konstrukten injiziert und mit 1-Octen-3-ol in unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert. Den Eizellen wurden (i) Wasser als Kontrolle, (ii) cRNA von BdorOR7a-6/BdorOrco, (iii) cRNA von BdorOR13a/BdorOrco injiziert. b Dosis-Wirkungs-Kurve von BdorOR7a-6 auf 1-Octen-3-ol. EC50 = 1,05 × 10−4 M. c Dosis-Wirkungs-Kurve von BdorOR13a auf 1-Octen-3-ol. EC50 = 1,268 × 10−6 M. Symbole zeigen die aktuellen Reaktionen des BdorOR/BdorOrco-Komplexes, dargestellt als Mittelwert ± SE (n = 8). Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mit GraphPad 8.0 angepasst. d–h Reaktionen auf 1-Octen-3-ol von HEK 293-Zellen, die BdorOR7a-6/BdorOrco oder BdorOR13a/BdorOrco coexprimieren. d Fluoreszenzbilder von HEK 293-Zellen, die mit Fluo4-AM inkubiert und mit den Kandidaten-OR-Genen transfiziert wurden. Fluo4-AM wurde verwendet, um die Fluoreszenzänderung (ΔF) über die Zeit anzuzeigen, und mCherry wurde als Reporter zur Beobachtung der erfolgreich transfizierten Zellen verwendet. Der Proportionalmaßstab beträgt 50 μm. e Änderung der Fluoreszenzintensität von Zellen, die BdorOR7a-6/BdorOrco exprimieren, nach Stimulation mit 10–4 M 1-Octen-3-ol. f Dosis-Wirkungs-Kurve von BdorOR7a-6 auf 1-Octen-3-ol. EC50 = 1,561 × 10−5 M. g Änderung der Fluoreszenzintensität von Zellen, die BdorOR13a/BdorOrco exprimieren, nach Stimulation mit 10−4 M 1-Octen-3-ol. h Dosis-Wirkungs-Kurve von BdorOR13a auf 1-Octen-3-ol. EC50 = 1,128 × 10−5 M.

Um die Zwei-Elektroden-Spannungsklemmdaten zu bestätigen, exprimierten wir die ORs in HEK 293-Zellen und detektierten die Fähigkeit der ORs, 1-Octen-3-ol durch Calcium-Bildgebung zu binden. Mit Fluo-4 AM inkubierte Zellen waren bei Anregung bei 488 nm grün, wohingegen Zellen, die erfolgreich mit den OR-Konstrukten und dem visuellen Marker mCherry transfiziert wurden, bei Anregung bei 555 nm rot waren (Abb. 2d). Nur mit BdorOR7a-6/BdorOrco oder BdorOR13a/BdorOrco transfizierte Zellen zeigten nach Stimulation mit 10–4 M 1-Octen-3-ol eine signifikante Änderung der grünen Fluoreszenzintensität (Abb. 2e, g), und die Konzentrations-Reaktionskurven zeigten EC50-Werte von 15,6 μM für BdorOR7a-6/BdorOrco und 11,3 μM für BdorOR13a/BdorOrco (Abb. 2f, h).

Wir haben gRNAs gegen die Gene BdorOR7a-6 und BdorOR13a entwickelt und sie zusammen mit gereinigtem Cas9-Protein in frisch gelegte B. dorsalis-Eier injiziert, um Knockout-Mutationen zu erzeugen. Die Zielstellen BdorOR7a-6 und BdorOR13a befanden sich im ersten bzw. zweiten Exon (Abb. 3b, c). Wir haben 26 Erwachsene in der BdorOR7a-6-Gruppe und 12 in der BdorOR13a-Gruppe erhalten. Mosaik-G0-Individuen wurden anhand der Analyse von Polymorphismen identifiziert und die G0-Mutationseffizienz betrug 13 % bzw. 22 % (Abb. 3a). TA-Klonierung und Sanger-Sequenzierung ergaben drei Genotypen unter den G0-BdorOR7a-6–/+-Mutanten und zwei unter den G0-BdorOR13a–/+-Mutanten. Die Mutanten wurden einzeln mit Wildtyp-Fliegen (WT-Fliegen) gekreuzt, und die G1-Nachkommen wurden für mindestens 10 Generationen mit WT-Fliegen rückgekreuzt, um mögliche Off-Target-Mutationen auszuschließen. Schließlich erhielten wir BdorOR7a-6−/−-Fliegen mit einer homozygoten 4-bp-Deletion und BdorOR13a-/−-Fliegen mit einer homozygoten 7-bp-Deletion (Abb. 3b, c). Die BdorOR7a-6-Aminosäuresequenz in den Mutanten wurde ab Position 236 verändert und erzeugte ein Stoppcodon an Position 254 (im Vergleich zum 394 Reste langen WT-Protein). Die BdorOR13a-Aminosäuresequenz in den Mutanten wurde ab Position 127 verändert und erzeugte ein Stoppcodon an Position 172 (im Vergleich zum 441 Reste langen WT-Protein).

a Überlebens- und Mutageneseraten nach Mikroinjektion. b Die Zielregion von BdorOR7a-6. (i) Genstruktur von BdorOR7a-6 basierend auf der Genomsequenz. Exons werden als graue Kästchen und Introns als Linien dargestellt. Das gRNA-Ziel im ersten Exon enthält eine 20-nt-Leitsequenz und das angrenzende grün hervorgehobene CGG ist das Protospacer-Nachbarmotiv (PAM). (ii) Die Genotypen der G0-Mutanten wurden durch TA-Klonierung und Sanger-Sequenzierung bestimmt (Deletionen werden als gelb hervorgehobene Striche angezeigt). Der den Mosaik-G0-Fliegen zugewiesene Identifikator wird vor jeder Sequenz angezeigt, und die Anzahl der gelöschten Nukleotide wird nach jeder Sequenz angezeigt. (iii) Sanger-Sequenzierungsspuren für WT-, BdorOR7a-6−/+- und BdorOR7a-6−/−-Fliegen. Die schwarze Region ist die gRNA-Zielstelle. (iv) Vorhergesagte Proteinsequenzen des BdorOR7a-6 WT und der mutierten (–4 bp) Allele. c Die Zielregion von BdorOR13a, wobei (i–iv) die gleichen Details angibt wie oben für die BdorOR7a-6-Mutanten.

Wir verglichen die elektrophysiologischen Reaktionen von Mutanten- und WT-Fliegen auf 1-Octen-3-ol und andere flüchtige Stoffe mittels Elektroantennographie (EAG). Die durchschnittliche EAG-Reaktion von WT-Fliegen nahm mit der Konzentration von 1-Octen-3-ol allmählich zu (Abb. 4a) und erreichte einen Spitzenwert von 3,829 ± 0,33 mV bei 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol. Die durchschnittlichen EAG-Reaktionen der Mutanten waren mit 0,1 %, 1 % und 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol im Vergleich zu den WT-Fliegen signifikant niedriger. Darüber hinaus waren die EAG-Reaktionen der BdorOR13a-/−-Mutanten bei 1 % und 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol niedriger als die der BdorOR7a-6-/−-Mutanten. Allerdings zeigte die EAG-Reaktion der BdorOR7a-6–/–- und BdorOR13a–/–-Mutanten auf die anderen drei flüchtigen Stoffe (Ethyltiglat, Ethylacetat und Ethylbutyrat) keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu WT-Fliegen.

a EAG-Reaktionen von WT-, BdorOR7a-6−/−- und BdorOR13a−/−-Mutanten auf unterschiedliche Konzentrationen von 1-Octen-3-ol und anderen flüchtigen Stoffen. Die Daten sind Mittelwerte ± SE (n = 15–20). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Student-t-Tests (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001) bestimmt. b Durch 1-Octen-3-ol induziertes Eiablageverhalten bei WT- und mutierten Weibchen. Die Wärmekarte zeigt die Spurendichte und die verbrachte Zeit von acht Weibchen, wobei Rot die höchste Dichte anzeigt. Die Bilder zeigen das Ausmaß der Eiablage nach 24 Stunden und das Histogramm zeigt die durchschnittliche Anzahl der von jeder Fliege gelegten Eier. Die Daten sind Mittelwerte ± SE (n ≥ 8 biologische Replikate). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Student-t-Tests bestimmt (***p < 0,001).

Um die Effizienz von 1-Octen-3-ol als Lockmittel für WT- und mutierte Weibchen zu vergleichen, wurden Eiablage-Bioassays durchgeführt, wobei der gleiche Versuchsaufbau wie oben beschrieben verwendet wurde (Abb. 1c). Die durchschnittliche Anzahl der von jedem WT-Weibchen an der 1-Octen-3-ol-Stelle gelegten Eier betrug 28 ± 3 (n = 12), verglichen mit fast 0 (n = 12) Eiern an der mit MO behandelten Stelle (p < 0,001). , Student-t-Test, Abb. 4b). Allerdings war die mittlere Anzahl der von den mutierten Fliegen an der 1-Octen-3-ol-Stelle gelegten Eier deutlich niedriger: 4 ± 1 (n = 13, p < 0,001, Student-t-Test, Abb. 4b) für BdorOR7a-6 −/− Mutanten und 2 ± 1 (n = 16, p < 0,001, Student-t-Test, Abb. 4b) für BdorOR13a−/− Mutanten. Am MO-Standort gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen WT-Fliegen und mutierten Fliegen. Darüber hinaus waren die Spuren der Mutanten BdorOR7a-6–/– und BdorOR13a–/– ungeordnet und bedeckten die gesamte Petrischale, im Gegensatz zu den WT-Spuren, die sich um den Lockstoff herum konzentrierten. Das Verhalten der Mutanten BdorOR7a-6–/– und BdorOR13a–/– wird in den Zusatzfilmen 5–6 gezeigt.

Wir haben AlphaFold 2.0 verwendet, um die Strukturen von BdorOR7a-6 und BdorOR13a vorherzusagen (Abb. 5a, c). Die Genauigkeit der Vorhersage wurde mithilfe eines PROCHECK Ramachandran-Diagramms bewertet. Dabei wurde festgestellt, dass 96, 7% der BdorOR7a-6-Reste in bevorzugten Regionen (A, B, L) und keine Rückstände in nicht zugelassenen Regionen platziert wurden (ergänzende Abbildung 4a). In ähnlicher Weise wurden 95, 3% der BdorOR13a-Reste in bevorzugten Regionen platziert und keine Reste in nicht zugelassenen Regionen (ergänzende Abbildung 4b). Durch molekulares Andocken zeigte sich, dass BdorOR7a-6 und BdorOR13a über einen länglichen, taschenartigen Hohlraum verfügen, der 1-Octen-3-ol bindet. Es wurde vorhergesagt, dass der Rest Asn86 von BdorOR7a-6 (Abb. 5b) und die Reste Asp320 und Lys323 von BdorOR13a (Abb. 5d) Wasserstoffbrückenbindungen mit 1-Octen-3-ol bilden. Die Richtigkeit der drei Bindungsstellen wurde durch ortsspezifische Mutagenese bestimmt, bei der jede Stelle einzeln durch Alanin ersetzt wurde. Die drei mutierten Sequenzen wurden zusammen mit dem BdorOrco-Konstrukt in HEK 293-Zellen transfiziert, gefolgt von einer Calcium-Bildgebung wie oben beschrieben. Die Mutation Asn86Ala reduzierte die Bindungsaffinität von BdorOR7a-6 für 1-Octen-3-ol deutlich und erhöhte den EC50-Wert auf 46,7 μM. Die Mutationen Lys323Ala und Asp320Ala machten die Fähigkeit von BdorOR13a, 1-Octen-3-ol zu binden, zunichte, sodass in beiden Fällen kein EC50-Wert erfasst werden konnte (Abb. 5e, f). Darüber hinaus zeigten die molekularen Docking-Ergebnisse, dass die drei Mutationen keine Wasserstoffbrückenbindungen mit 1-Octen-3-ol bilden konnten (ergänzende Abbildung 5–6).

a Struktur von BdorOR7a-6, vorhergesagt mit AlphaFold 2.0. b Rest von BdorOR7a-6, der für die Bindung an 1-Octen-3-ol erforderlich ist. c Struktur von BdorOR13a, vorhergesagt mit AlphaFold 2.0. d Reste von BdorOR13a, die für die Bindung an 1-Octen-3-ol erforderlich sind. e Reaktion der BdorOR7a-6 Asn86Ala-Mutante auf 1-Octen-3-ol basierend auf Calcium-Bildgebung. f Reaktionen von BdorOR13a Asp320Ala- und Lys323Ala-Mutanten auf 1-Octen-3-ol basierend auf Calcium-Bildgebung.

Der Hauptbestandteil des weit verbreiteten kommerziellen Lockmittels für B. dorsalis ist Methyleugenol, das Männchen stark, aber nicht Weibchen anlockt21. Im Freiland hat die Anlockung der Männchen nach der Paarung keine positive Wirkung, da dadurch die Eiablage trächtiger Weibchen und die dadurch verursachten Larvenschäden nicht verhindert werden. Die erfolgreiche Bekämpfung von B. dorsalis erfordert daher entweder eine Unterbrechung der Paarung oder einen weiblichen Lockstoff. Trächtige Weibchen legen Eier lieber in reife Mangofrüchte7,8,9,10, und 1-Octen-3-ol wurde als einer der olfaktorischen Hinweise vorgeschlagen, die dieses Eiablageverhalten steuern könnten11,12. Wir fanden heraus, dass 1-Octen-3-ol für begattete Weibchen attraktiver ist als für Jungfrauen, was es zu einem idealen Kandidaten für die Entwicklung eines weiblichen Lockstoffs macht. Interessanterweise war 1-Octen-3-ol die bevorzugte Wahl, als Mango und 1-Octen-3-ol als Alternativen angeboten wurden, und veranlasste die trächtigen Weibchen auch dazu, mehr Eier zu legen. Dies weist darauf hin, dass 1-Octen-3-ol nicht nur Weibchen anlockt, sondern auch die Eiablageaktivität stimuliert.

BdorOrco-/−-Mutanten reagieren in EAG-Experimenten nicht auf 1-Octen-3-ol und zeigen in unserer vorherigen Studie eine signifikante Veränderung im Eiablageverhalten20. Da Orco für die Wahrnehmung von Geruchsreizen bei Insekten unbedingt erforderlich ist, muss das durch 1-Octen-3-ol gesteuerte Eiablageverhalten durch ORs vermittelt werden. Obwohl mehrere Versuche unternommen wurden, die ORs für 1-Octen-3-ol zu identifizieren, blieb die molekulare Grundlage seiner Wahrnehmung aufgrund des Fehlens einer qualitativ hochwertigen Genomsequenz bislang weitgehend unbekannt16. Wir haben daher die OR-Gene von B. dorsalis mithilfe einer hochwertigen Genomassemblierung und mehrerer transkriptomischer Datenbanken annotiert. Wir fanden 74 B. dorsalis-OR-Kandidatengene, das bislang umfassendste Repository, von denen wir 64 durch RT-PCR klonierten und durch Sanger-Sequenzierung bestätigten. Diese Daten bilden eine solide Grundlage für die funktionelle Charakterisierung weiterer OPs in der Zukunft. Die phylogenetische Analyse von ORs von B. dorsalis und D. melanogaster ergab einige direkte Orthologe, aber auch andere Fälle von Genduplikation und -divergenz, wie bereits berichtet16, was Anpassungen an Umweltgerüche wie flüchtige Pflanzenstoffe widerspiegelt. Es wäre interessant zu bestimmen, ob diese homologen ORs an der Wahrnehmung spezifischer Geruchsstoffe oder Gruppen analoger Geruchsstoffe beteiligt sind. Die OR-Gene von B. dorsalis werden hauptsächlich in Riechorganen exprimiert, wie bereits für D. melanogaster22 berichtet. Obwohl bei B. dorsalis über sexuell dimorphe Reaktionen auf flüchtige Stoffe berichtet wurde21,23,24, beobachteten wir in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen keine signifikanten transkriptomischen Unterschiede zwischen Männern und Frauen16.

Der Paarungsstatus ist ein Schlüsselschalter für Insekten, der es ihnen ermöglicht, in den Zustand der Bereitschaft zur Eiablage zu gelangen, der das Eiablageverhalten auslöst25. Beispielsweise wechseln begattete Weibchen der mediterranen Fruchtfliege Ceratitis capitata ihre Präferenz von männlichen Pheromonen zu Wirtsfruchtduftstoffen26. Es wird vorhergesagt, dass der Paarungsstatus von Weibchen ihre Wahrnehmung flüchtiger Stoffe sowie ihren neuen Verhaltenszustand und ihre physiologischen Bedürfnisse beeinflusst27, und dementsprechend stellten wir in der vorliegenden Studie fest, dass 1-Octen-3-ol für die Paarung attraktiver war als jungfräuliche Weibchen. Wir fanden 20 OR-Gene von B. dorsalis, die bei verpaarten Weibchen hochreguliert waren, und betrachteten sie als Kandidaten-ORs für die Wahrnehmung von 1-Octen-3-ol, aber nur BdorOR7a-6 und BdorOR13a zeigten eine signifikante Reaktion auf 1-Octen-3 -ol. Orthologe von BdorOR13a reagieren in ähnlicher Weise auf 1-Octen-3-ol in D. melanogaster28, Anopheles gambiae29 und Spodoptera frugiperda30.

Heterologe Expressionssysteme, einschließlich Oozyten von Die Spannungsklemmenaufzeichnung zeigte, dass BdorOR7a-6 einen deutlich größeren EC50-Wert als BdorOR13a aufwies, wohingegen die Kalziumbildgebung keinen signifikanten Unterschied zwischen den Rezeptoren zeigte. Diese inkongruenten Ergebnisse können die inhärenten Eigenschaften jedes heterologen Systems und/oder Unterschiede in den Messtechniken widerspiegeln32. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse unserer Spannungsklemmenaufzeichnung in einer anderen Studie, dass BdorOR7a-6 auf die beiden anderen flüchtigen Stoffe reagieren konnte, was darauf hindeutet, dass BdorOR7a-6 im Vergleich zu BdorOR13a weitgehend auf flüchtige Wirtsstoffe abgestimmt war.

Das durch 1-Octen-3-ol induzierte Eiablageverhalten war in den Mutanten BdorOR7a-6−/− und BdorOR13a−/− signifikant verändert. Trächtige mutierte Weibchen legten nach Stimulation mit 1-Octen-3-ol weitaus weniger Eier als WT-Fliegen, und die verringerte Geruchsempfindlichkeit gegenüber 1-Octen-3-ol störte auch die Spuren der mutierten Fliegen. Die Videos S1–S4 zeigen, dass WT-Weibchen das 1-Octen-3-ol schnell lokalisierten und dann Eier darum legten, wohingegen die Mutanten in vielen Fällen nicht in der Lage waren, das 1-Octen-3-ol zu lokalisieren. Allerdings legten die Weibchen immer noch deutlich mehr Eier auf der mit 1-Octen-3-ol behandelten Seite als MO. Dies macht Sinn, wenn man bedenkt, dass wir die Doppel-Knockouts nicht durchgeführt haben, sodass der andere OP die Eiablage teilweise retten konnte. BdorOR13a und BdorOR7a-6 scheinen daher auf 1-Octen-3-ol abgestimmt zu sein, was das Eiablageverhalten reguliert. Dies steht im Einklang mit Befunden bei der Mücke Culex quinquefasciatus, wo die Rezeptoren CquiOR37 und CquiOR99 eng auf zwei Lockstoffe für die Eiablage (4-Methylphenol und 4-Ethylphenol) abgestimmt sind, diese Präferenz geht jedoch bei den Mutanten CquiOR37–/– und CquiOR99–/– verloren 33. OR-abhängige olfaktorische Reaktionen sind daher für ein geruchsgesteuertes Eiablageverhalten notwendig. Die BdorOR7a-6–/–- und BdorOR13a–/–-Mutanten zeigten auch eine signifikant geringere EAG-Reaktion auf 1-Octen-3-ol als WT-Fliegen, wobei BdorOR13a–/–-Mutanten den größten Mangel aufwiesen. Der EC50-Wert von BdorOR13a (1,27 µM) war im Spannungsklemmentest ebenfalls viel niedriger als der von BdorOR7a-6 (105 µM). Diese Daten deuten darauf hin, dass BdorOR13a der primäre OR für die Wahrnehmung von 1-Octen-3-ol ist, obwohl jeder Rezeptor den Knockout des anderen teilweise kompensieren kann.

Ortsgerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um die Bindungseigenschaften von Insekten-ORs und Geruchsstoffen zu untersuchen34,35,36. In dieser Studie waren die Asp320Ala- und Lys323Ala-Mutanten von BdorOR13a nicht in der Lage, 1-Octen-3-ol zu binden, was darauf hindeutet, dass die Mutation die Konformation der Bindungstasche veränderte. Die Asn86Ala-Mutante von BdorOR7a-6 behielt ihre Fähigkeit, 1-Octen-3-ol zu binden, aber die Bindungsaffinität war viel geringer, was darauf hindeutet, dass sich die kompakte Struktur der Bindungsstelle möglicherweise entspannt hat37. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Ostrinia furnacalis38, D. melanogaster39 und A. gambiae40 berichtet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Konformation von ORs durch den Austausch einzelner Aminosäuren beeinflusst wird und dass die Asp320- und Lys323-Reste von BdorOR13a absolute Voraussetzungen für die 1-Octen-3-ol-Bindung sind. Die weitere Analyse von OR-Strukturen könnte einen besseren Einblick in die Konformationsänderungen bei der Geruchsstoffbindung liefern und das Screening von Geruchsstoffen erleichtern, die B. dorsalis effizienter anziehen, indem sie mit größerer Affinität an ORs binden.

Zusammenfassend stellten wir fest, dass 1-Octen-3-ol ein starker Lockstoff für trächtige B. dorsalis-Weibchen ist und auch deren Eiablageverhalten reguliert. Wir haben die genomweite Annotation von B. dorsalis-ORs abgeschlossen und mithilfe von In-vitro-Bindungstests und Genomeditierung gefolgt von Verhaltenstests gezeigt, dass zwei Rezeptoren (BdorOR13a und BdorOR7a-6) auf 1-Octen-3-ol abgestimmt sind. Unsere Ergebnisse zeigen nicht nur das Potenzial von 1-Octen-3-ol für die Anziehung trächtiger B. dorsalis-Weibchen, sondern offenbaren auch die molekulare Grundlage seiner Wahrnehmung. Dies könnte die Entwicklung wirksamerer weiblicher Lockstoffe erleichtern, um die Auswirkungen von B. dorsalis auf Obstkulturen zu verringern.

WT B. dorsalis wurden 2008 in Haikou, Provinz Hainan, China, gesammelt. Sie wurden im Schlüssellabor für Entomologie und Schädlingsbekämpfungstechnik in Chongqing bei 27 ± 1 °C, 70 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 14-prozentigen relativen Luftfeuchtigkeit gehalten. h Photoperiode. Erwachsene Fliegen wurden mit einer künstlichen Diät aufgezogen, die Honig, Zucker, Hefepulver und Vitamin C enthielt. Frisch geschlüpfte Larven wurden auf eine künstliche Diät mit Mais- und Weizenkeimmehl, Hefepulver, Agar, Zucker, Sorbinsäure, Linolsäure usw. übertragen Filterpapier.

Es wurden Doppelfallen-Ködertests durchgeführt, um die Geruchspräferenzen trächtiger und jungfräulicher Weibchen in einem 20 × 20 × 20 cm großen transparenten Käfig mit gleichmäßig verteilten Löchern (Durchmesser = 1,5 mm) an den Seitenwänden zu vergleichen. Die Fallen wurden aus umgedrehten 50-ml-Zentrifugenröhrchen umgerüstet und entlang der Diagonale des Käfigs platziert. Die Oberseite jeder Falle wurde mit einer 1-ml-Pipettenspitze durchstochen, die gekürzt wurde, um sicherzustellen, dass Fliegen über die Pipette auf die Falle zugreifen konnten. Für den olfaktorischen Präferenztest mit Mango wurde eine Falle mit 60 mg Mangofleisch und die andere Falle mit 20 μl MO im Deckel eines 200 μl-PCR-Röhrchens beladen. Für den olfaktorischen Präferenztest mit 1-Octen-3-ol (≥98 %, Sigma, USA) wurde eine Falle mit 20 μl 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol, verdünnt in MO, beladen und die andere mit 20 μL MO. Ein mit Wasser getränkter Wattebausch wurde in die Mitte des Käfigs gelegt, um die Fliegen mit Wasser zu versorgen. Für jedes Experiment wurden Gruppen von 30 weiblichen Fliegen in den Käfig eingeführt und jedes Experiment wurde wiederholt, um acht biologische Replikate zu erhalten. Alle Experimente begannen um 10 Uhr, um die zirkadiane Konsistenz sicherzustellen. Die Anzahl der Fliegen in jeder Falle wurde 24 Stunden lang alle 2 Stunden gezählt. Wir verglichen die Vorlieben von 3 Tage alten unreifen Weibchen, 15 Tage alten jungfräulichen Weibchen und 15 Tage alten begatteten Weibchen. Der olfaktorische Präferenzindex wurde anhand der folgenden Formel41 berechnet: (Anzahl der Fliegen in der Mango-/Duftstofffalle – Anzahl der Fliegen in der Kontrollfalle)/Gesamtzahl der Fliegen.

Das Eiablageverhalten wurde in einem 10 × 10 × 10 cm großen transparenten Käfig mit gleichmäßig verteilten Löchern an den Seitenwänden wie oben überwacht. Als Eiablagesubstrat diente eine 9-cm-Petrischale, gefüllt mit 1 % Agar, und das Mangofleisch, 10 % (v/v) 1-Octen-3-ol oder MO wurden an gegenüberliegenden Rändern der Schale hinzugefügt. Wir haben die Präferenz von Fliegen für verschiedene Substrate getestet: (1) ~60 mg Mangofleisch an einer Kante und 20 μl MO an der anderen; (2) 20 μL 1-Octen-3-ol auf einer Kante und 20 μL MO auf der anderen; (3) ~60 mg Mangofleisch auf einer Kante und 20 μL 1-Octen-3-ol auf der anderen; und (4) ~60 mg Mangofleisch plus 20 μL 1-Octen-3-ol auf der einen Seite und ~60 mg Mangofleisch plus 20 μL MO auf der anderen Seite. Die Agarscheibe war mit einer durchstochenen Plastikfolie bedeckt, um die Fruchtschale nachzuahmen, was Fliegen dazu ermutigt, ihren Legebohrer in die Plastikfolie zu strecken, um Eier zu legen. Die Agarscheibe wurde in die Mitte des Käfigs gelegt und wir setzten acht 15 Tage alte trächtige Weibchen ein. Zwei Sony FDR-AX40-Kameras zeichneten 24 Stunden lang das Verhalten der Fliegen auf, eine über dem Käfig befestigt, um die Spuren aufzuzeichnen, und die andere vor dem Käfig platziert, um das Eiablageverhalten aufzuzeichnen. Basierend auf den Ergebnissen von Doppelfallen-Anlockungstests wurde eine Videodauer von 3 Stunden (6–9 Stunden) ausgewählt, um die Spuren und die Aufenthaltsdauer aller Fliegen im beobachteten Bereich (der Oberfläche der Petrischale) zu analysieren. Die Videos wurden mit EthoVision XT v16 (Noldus Information Technology) analysiert, um die Gesamtzeit aller Fliegen auf jeder Seite in Sekunden und die Gesamtbewegungsstrecke in Zentimetern zu ermitteln, und die Spuren wurden in Form von Heatmaps17 visualisiert. Die Anzahl der von den acht Fliegen in jedem Experiment gelegten Eier wurde unter einem CNOPTEC-Stereomikroskop gezählt und jede Versuchsgruppe umfasste 7–16 Wiederholungen.

Vom National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) heruntergeladene Aminosäuresequenzen von D. melanogaster wurden als BLASTP-Abfragen für die Aminosäuredatenbank von B. dorsalis mit einem Identitäts-Cut-off von verwendet 30 %. Die OR-Kandidatengene wurden mit tiefen Transkriptomdaten von B. dorsalis Antennae42, Oberkieferpalpen und Rüssel sowie anderen Geweben verglichen.

Die High-Fidelity-DNA-Polymerase PrimerSTAR Max (TaKaRa, Dalian, China) wurde verwendet, um den vollständigen offenen Leserahmen der BdorOR-Gene durch verschachtelte PCR unter Verwendung von Primern (Ergänzungstabelle 2) zu verstärken, die gemäß den Genomdaten von B. dorsalis entwickelt wurden. Jede 25-μL-Reaktion umfasste 12,5 μL 2 × PrimerSTAR Max Premix (TaKaRa), 10,5 μL Reinstwasser, 1 μL jedes Primers (10 μM) und 1 μL der cDNA-Matrize. Auf einen ersten Denaturierungsschritt bei 98 °C für 2 Minuten folgten 35 Zyklen von 10 Sekunden bei 98 °C, 15 Sekunden bei 55 °C und 90 Sekunden bei 72 °C sowie ein letzter Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C . Gereinigte PCR-Produkte wurden zur Sequenzierung auf den Vektor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) übertragen (BGI, Peking, China).

Die Gesamt-RNA wurde aus (i) männlichen und weiblichen Antennen, Oberkieferpalpen, Kopfkutikula (ohne Antenne, Oberkieferpalpen und Rüssel), Rüssel, Beinen, Flügeln und Legebohrern und (ii) aus den Köpfen von 15 Tage alten Tieren extrahiert jungfräuliche und begattete Weibchen unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA). Genomische DNA wurde mit RNase-freier DNase I (Promega) eliminiert und Erststrang-cDNA wurde aus 1 µg Gesamt-RNA unter Verwendung des PrimeScript RT-Reagenzienkits (TaKaRa) synthetisiert. Standardkurven wurden verwendet, um die Primereffizienz (Ergänzungstabelle 3) mit fünffachen Reihenverdünnungen von cDNA zu bewerten. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) wurde mit einem CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 µL mit 5 µL SYBR Supermix (Novoprotein, Shanghai, China) durchgeführt. , 3,9 μL nukleasefreies Wasser, 0,5 μL cDNA (~200 ng/μL) und 0,3 μL der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM). Wir verwendeten α-Tubulin (GenBank: GU269902) und ribosomales Protein S3 (GenBank: XM_011212815) als interne Referenzgene. Für jedes Experiment wurden vier biologische Replikate hergestellt. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2−∆∆Ct-Methode43 bestimmt und die Daten mit SPSS v20.0 (IBM) analysiert.

Verifizierte PCR-Produkte, die potenzielle OR-Gene von B. dorsalis und BdorOrco darstellen, wurden zur Expression in Eizellen auf den Vektor pT7Ts übertragen. Die Plasmide wurden für die Synthese von cRNAs mit dem mMESSAGE mMACHINE T7 Kit (Invitrogen, Litauen) linearisiert. Die gereinigte cRNA wurde auf 2 µg/µL verdünnt und etwa 60 ng cRNA in X. laevis-Oozyten injiziert. Die Eizellen wurden mit 1,5 mg/ml Kollagenase I (GIBCO, Carlsbad, CA) in Waschpuffer (96 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7,6) 30–40 Minuten lang bei Raum vorbehandelt Temperatur vor der Injektion. Nach 2-tägiger Inkubation bei 18 °C in Ringer-Lösung (96 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 0,8 mM CaCl2) wurden die Eizellen verschiedenen Konzentrationen von verdünntem 1-Octen-3-ol ausgesetzt in Ringer-Lösung aus einem 1 M Vorrat an DMSO. Geruchsstoffinduzierte Ganzzell-Einwärtsströme wurden von injizierten Eizellen unter Verwendung einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme und eines OC-725C-Verstärkers (Warner Instruments, Hamden, CT) bei einem Haltepotential von –80 mV aufgezeichnet. Das Signal wurde mit einem Tiefpassfilter bei 50 Hz verarbeitet und bei 1 kHz digitalisiert. Als Negativkontrolle dienten Eizellen, denen nukleasefreies Wasser injiziert wurde. Die Daten wurden mit einem Digidata 1550 A-Gerät (Warner Instruments, Hamden, CT) erfasst und mit der Software pCLAMP10.5 (Axon Instruments Inc., Union City, CA) analysiert.

Verifizierte PCR-Produkte, die OR-Kandidatengene von B. dorsalis und BdorOrco darstellen, wurden zusammen mit einem mCherry-Tag, der rote Fluoreszenz verleiht, auf den Vektor pcDNA3.1(+) übertragen, um die Transfektion zu bestätigen. Hochwertige Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen-Plasmid-MIDIprep-Kit (QIAgen, Düsseldorf, Deutschland) hergestellt. Die Plasmide B. dorsalis OR und BdorOrco wurden unter Verwendung des TransIT-LT1-Transfektionsreagenzes (Mirus Bio LLC, Japan) in Platten mit 96 Vertiefungen in HEK 293-Zellen co-transfiziert. Der Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM (Invitrogen) wurde als 1 mM Stammlösung in DMSO hergestellt und in Hanks‘ ausgewogener Salzlösung (HBSS, Invitrogen, Litauen) auf 2,5 μM verdünnt, um als Kalziumindikator zu dienen. Das Zellkulturmedium wurde 24–30 Stunden nach der Transfektion entfernt und die Zellen wurden dreimal mit HBSS gespült, bevor Fluo 4-AM hinzugefügt und die Zellen 1 Stunde lang im Dunkeln inkubiert wurden. Nach drei Spülungen in HBSS wurden 99 μl frisches HBSS in jede Vertiefung gegeben, bevor im Dunkeln mit 1 μl verdünntem 1-Octen-3-ol getestet wurde. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss, Deutschland) aufgenommen. Fluo 4-AM wurde bei 488 nm und mCherry bei 555 nm angeregt. Die relative Änderung der Fluoreszenz (ΔF/F0) wurde verwendet, um die Änderung von Ca2+ darzustellen, wobei F0 die Grundlinienfluoreszenz und ΔF die Differenz zwischen der durch 1-Octen-3-ol-Stimulation induzierten Spitzenfluoreszenz und der Grundlinie ist. Zur Analyse wurden die gesunden und erfolgreich transfizierten Zellen (rot bei Anregung bei 555 nm) verwendet. Die Endkonzentration von 10–4 M wurde zunächst zum Screening entsprechender ORs und anschließend zur Bestimmung der Reaktion der gescreenten ORs auf die Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von 1-Octen-3-ol verwendet. Jede Konzentration von 1-Octen-3-ol wurde dreifach getestet. Konzentrations-Reaktionskurven wurden mit GraphPad Prism v8.0 (GraphPad Software) erstellt.

Die Exonsequenzen von BdorOR7a-6 und BdorOR13a wurden mithilfe der hochwertigen B. dorsalis-Genomassemblierung vorhergesagt. Jede gRNA-Sequenz hatte eine Länge von 20 Nukleotiden plus NGG als Protospacer-Nachbarmotiv (PAM). Das Potenzial für Off-Target-Mutationen wurde mithilfe von CasOT zum Screening der B. dorsalis-Genomsequenz bewertet. Jede gRNA wurde mit dem GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit (Invitrogen) synthetisiert und mit dem GeneArt gRNA Clean-up Kit (Invitrogen) gereinigt. Embryonen wurden wie zuvor beschrieben mikroinjiziert20. Gereinigte gRNA und Cas9-Protein aus dem GeneArt Platinum Cas9 Nuclease Kit (Invitrogen) wurden gemischt und auf Endkonzentrationen von 600 bzw. 500 ng/µL verdünnt. Frische Eier (innerhalb von 20 Minuten gelegt) wurden gesammelt und 90 Sekunden lang 1 % Natriumhypochlorit ausgesetzt, um das Chorion aufzuweichen. Die Eier wurden auf Objektträgern fixiert und mit der Mischung aus gRNA und Cas9-Protein am hinteren Pol injiziert, wobei ein IM-300-Gerät (Narishige, Tokio, Japan) und mit einem Mikropipettenzieher Modell P-97 (Sutter Instrument Co., Japan) präparierte Nadeln verwendet wurden. Novato, CA). Als Negativkontrolle wurde den Eiern nukleasefreies Wasser injiziert. Die Injektion war innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen. Die injizierten Embryonen wurden in einem Inkubator bei 27 °C kultiviert und die Sterblichkeit während der anschließenden Entwicklung aufgezeichnet.

G0-Mutanten wurden wie zuvor beschrieben gescreent20. Erwachsene G0-Überlebende wurden einzeln mit WT-Fliegen (einzelnes Paar) rückgekreuzt, um G1-Nachkommen zu sammeln. Genomische DNA wurde aus G0-Individuen nach der Eiablage mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) extrahiert. Die Region um jedes gRNA-Ziel wurde durch PCR unter Verwendung der extrahierten DNA als Matrize, der in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten spezifischen Primer und 2 × Taq PCR MasterMix (Biomed, Peking, China) amplifiziert. PCR-Produkte wurden durch Kapillarelektrophorese mit dem QIAxcel DNA High Resolution Kit (Qiagen) analysiert. Von den WT-Allelen abweichende PCR-Produkte wurden gereinigt und zur Sequenzierung in den Vektor pGEM-T Easy übertragen. Um zu bestätigen, dass die Mutation vererbt wurde, wurde auch genomische DNA aus einem mesothorakalen Bein von G1-Fliegen mit InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, CA) extrahiert und wie oben analysiert. Um mögliche Off-Target-Mutationen zu vermeiden, wurden heterozygote G1-Mutanten mehr als 10 Generationen vor der Selbstkreuzung mit WT-Fliegen rückgekreuzt, um homozygote mutierte Fliegen zu erzeugen.

Die Antennenreaktionen von 15 Tage alten B. dorsalis-Erwachsenen auf 1-Octen-3-ol wurden, wie bereits berichtet, durch EAG-Aufzeichnung (Syntech, Niederlande) bestimmt20. Kurz gesagt, die Antennen wurden mit Spectra 360-Elektrodengel (Parker, Fairfield, NJ, USA) an zwei Elektroden befestigt. Die Signalantwort wurde mit einem IDAC4-Gerät verstärkt und mit der EAG-2000-Software (Syntech) erfasst. Vor jedem Experiment wurden 1-Octen-3-ol und andere drei flüchtige Stoffe (Ethyltiglat, Ethylacetat, Ethylbutyrat) mit MO auf 10 %, 1 % und 0,1 % (v/v) verdünnt, um als elektrophysiologischer Stimulus zu dienen. und MO wurde als Negativkontrolle verwendet. Mithilfe eines Controllers (Syntech) wurde ein konstanter Luftstrom (100 ml/min) erzeugt, um die Antenne zu stimulieren. Anschließend gaben wir 10 µL jeder Verdünnung oder MO auf ein Stück Filterpapier (5 × 1 cm) und die Negativkontrolle (MO) wurde vor und nach den verdünnten Duftstoffen aufgetragen, um das Antwortsignal zu kalibrieren. Die EAG-Reaktionen bei jeder Konzentration wurden für 15–20 Antennen aufgezeichnet, und jede Konzentration wurde zweimal aufgezeichnet. Jeder Test dauerte 1 s und der Abstand zwischen den Tests betrug 30 s. EAG-Reaktionsdaten von WT und mutierten Fliegen für die verdünnten Geruchsstoffe wurden mithilfe des Student-t-Tests mit SPSS v20.0 analysiert.

Die dreidimensionalen Strukturen von BdorOR7a-6 und BdorOR13a wurden mit AlphaFold 2.044 modelliert. Die Qualität und Rationalität jeder Proteinstruktur wurde online mithilfe eines PROCHECK Ramachandran-Diagramms in SAVES 6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/) bewertet. Für die Docking-Analyse wurde AutoDock Vina 1.1.2 verwendet, und die Rezeptorproteinstruktur und die Ligandenmolekularstruktur wurden mit AutoDock 4.2.6 vorbehandelt. Die Docking-Parameter wurden entsprechend der Proteinstruktur und den aktiven Stellen eingestellt und das optimale Docking-Modell wurde basierend auf der Affinität (kcal/mol) ausgewählt. Docking-Modelle wurden zur Analyse und Bildverarbeitung in Pymol und Discovery Studio 2016 Client importiert. Basierend auf den molekularen Docking-Daten wurden drei Reste (Asn86 in OR7a-6, Asp320 und Lys323 in OR13a) durch ortsspezifische Mutagenese45 unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten Primer durch Alanin ersetzt. Calcium-Imaging-Assays und molekulares Docking mutierter Proteine wurden dann wie oben beschrieben durchgeführt.

Alle olfaktorischen Präferenztests, Eiablage-Biotests, Expressionsprofilanalysen und EAG-Aufzeichnungstests wurden mit dem Student-t-Test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001) mit SPSS v20.0 (IBM) analysiert ). Die Zahlen wurden mit GraphPad v8.0 (GraphPad-Software) erstellt. Die Probengröße jedes Tests wurde im Manuskript angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die endgültigen Genomdaten der Chromosomenassemblierung und die Transkriptomdaten für Oberkieferpalpus und andere Gewebe wurden an CNGBdb unter der Assemblierungszugangsnummer CNP0003192, CNP0003333 bzw. CNP0003334 übermittelt. Die Deep-Transkriptom-Daten für die Antenne wurden im National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA) unter der Zugangsnummer SRR9026238 hinterlegt.

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Diese Forschung wurde durch Mittel des National Key R&D Program of China (2021YFC2600100, 2022YFC2601000), der National Natural Science Foundation of China (U21A20222, 32072491) und des China Agriculture Research System (CARS-26) von MOF und MARA unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Li Xu, Hong-Bo Jiang.

Schlüssellabor für Entomologie und Schädlingsbekämpfungstechnik, Hochschule für Pflanzenschutz, Südwestuniversität, Chongqing, 400716, China

Li Xu, Hong-Bo Jiang, Jie-Ling Yu, Deng Pan, Yong Tao, Quan Lei, Yang Chen, Zhao Liu und Jin-Jun Wang

Staatliche Anbaubasis für Pflanzenstressbiologie für südliche Berggebiete, Akademie der Agrarwissenschaften, Südwestuniversität, Chongqing, China

Li Xu, Hong-Bo Jiang, Jie-Ling Yu, Deng Pan, Yong Tao, Quan Lei, Yang Chen, Zhao Liu und Jin-Jun Wang

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LX, HJ, ZL und JW haben die Forschung entworfen; LX, JY und QL führten die Forschung durch; LX, DP und YT analysierten die Daten; LX, HJ und JW haben den Artikel geschrieben; YC züchtete die Wildtyp-Fliegen und untersuchte mutierte Fliegen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jin-Jun Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Tierversuche: Alle Verfahren in dieser Studie wurden vom Animal Care and Use Committee der Southwest University genehmigt. Der Xenopus laevis wurde 30 Minuten lang durch Eisbad betäubt, die Wunden wurden sorgfältig behandelt, um Infektionen zu vermeiden und Leiden zu minimieren.

Communications Biology dankt Dan-Dan Zhang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Hannes Schuler und Luke R. Grinham.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, L., Jiang, HB., Yu, JL. et al. Zwei Geruchsrezeptoren regulieren das durch 1-Octen-3-ol induzierte Eiablageverhalten bei der orientalischen Fruchtfliege. Commun Biol 6, 176 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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Eingegangen: 28. August 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 15. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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