Atypische Veränderungen in Zellen von Candida albicans, die mit Venetin behandelt wurden

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2844 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In der vorliegenden Forschung wurde die Wirkung eines Protein-Polysaccharid-Komplexes Venetin-1, der aus der Zölomflüssigkeit des Regenwurms Dendrobaena veneta gewonnen wurde, auf Zellen von Candida albicans charakterisiert. Die Verbindung zerstörte Pilzzellen, ohne eine Zytotoxizität gegenüber menschlichen Hautfibroblasten zu zeigen, was in früheren Studien nachgewiesen wurde. Da dieser Komplex eine Wirkung auf die Zellwand und Membran des Pilzes hatte, wurde er mit dem bekannten antimykotischen Antibiotikum Fluconazol verglichen. Beide Präparate störten die Teilung der Hefezellen und führten zur Bildung von Aggregaten und Ketten ungetrennter Zellen, was durch Anfärbung mit Fluorochromen verdeutlicht wurde. Die Fluoreszenzfärbung der Zellwand mit Calcofluor White ermöglichte den Vergleich der nach Einwirkung beider Substanzen gebildeten Aggregattypen. Die mit Kongorot durchgeführte Analyse zeigte, dass Venetin-1 tiefere Schichten der Zellwand freilegte, während nach der Verwendung von Fluconazol kein solcher Effekt sichtbar war. Die FTIR-Analyse bestätigte Veränderungen in der Mannoproteinschicht der Zellwand nach der Anwendung des Venetin-1-Komplexes. Die Färbung mit Rhodamin 123 und der Einsatz von Durchflusszytometrie ermöglichten einen Vergleich der Veränderungen in den Mitochondrien. Nach der Venetin-1-Anwendung wurden deutlich verlängerte Mitochondrien beobachtet, nicht jedoch nach der Anwendung des klassischen Antibiotikums. Die Phasenkontrastmikroskopie zeigte eine Vakuolenvergrößerung nach der Venetin-1-Anwendung. Die durchflusszytometrische Analyse von C. albicans-Zellen, die mit Venetin-1 und Fluconazol behandelt wurden, zeigte, dass beide Substanzen eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit verursachten.

Der medizinische Fortschritt hat sich in den letzten Jahren sowohl in der Chirurgie als auch in der Behandlung chronischer Krankheiten und Infektionen erheblich beschleunigt. Daher ist die Zahl der Patienten mit geschwächter Immunität infolge einer chirurgischen Behandlung, einer Antibiotikatherapie, einer Chemotherapie oder einer Behandlung auf der Intensivstation eines Krankenhauses gestiegen1,2,3,4. Die Schattenseite dieser Situation ist die zunehmende Zahl nosokomialer Infektionen. Sie werden unter anderem durch den übermäßigen Einsatz von Antibiotika verursacht, der zur Entwicklung einer mikrobiellen Resistenz gegen häufig verwendete Medikamente führt5. Infektionen mit nosokomialen Erregern verlängern den Aufenthalt des Patienten in einer medizinischen Einrichtung und erhöhen die Behandlungskosten2,3,6.

Candida-Pilze, insbesondere Candida albicans, sind ein Beispiel für Krankheitserreger, die solche Infektionen verursachen. C. albicans ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der auf der Oberfläche von Haut und Schleimhäuten sowie als Teil der Darmflora bei gesunden Probanden lebt7,8,9. Bei immungeschwächten Patienten verursacht dieser Pilz Infektionen der Haut und Schleimhäute sowie lebensbedrohliche systemische Candidiasis und systemische Infektionen7,10,11. Dieser Hefepilz ist der vierthäufigste Krankheitserreger auf der Intensivstation in den USA und der erste in Europa3,4. Candida-Blutinfektionen im Zusammenhang mit Aufnahmen auf der Intensivstation machen etwa 40 % der Fälle aus, wobei 9,3 % der Patienten eine Sepsis entwickeln2.

C. albicans verdankt seinen Erfolg als Krankheitserreger der hohen Plastizität des Genoms, der Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen, der Produktion lytischer Enzyme und der Fähigkeit, an Oberflächen zu haften7,9,11,12,13. Für Patienten sind Biofilme besonders gefährlich. Sie können sowohl auf natürlichen als auch auf künstlichen Oberflächen gebildet werden. Biofilme sind resistent gegen hohe Konzentrationen antimykotischer Antibiotika, wodurch sie schwer zu entfernen sind, und sie sind eine Quelle pathogener Zellen, die neue Infektionsherde im Körper erzeugen können7,14,15. Es wird geschätzt, dass die Sterblichkeitsrate bei mit Candida infizierten Personen bis zu 40 % betragen kann2,3,16,17.

Fluconazol ist eines der am häufigsten verwendeten Antibiotika zur Behandlung von Candidiasis. Es handelt sich um ein Azol-Antibiotikum, das durch Hemmung des Enzyms 14-α-Sterol-Demethylase wirkt, das an der Synthese von Membransterinen beteiligt ist7. Dadurch kommt es zu einer Veränderung der Eigenschaften und Struktur der Zellmembran, was zu einer Hemmung des Pilzwachstums führt. Trotz der geringen Toxizität von Fluconazol gegenüber Wirtszellen wird zunehmend berichtet, dass das Medikament bei der Behandlung von Candidiasis unwirksam ist7. Dies wird durch die Entwicklung einer Antibiotikaresistenz durch Mikroorganismen durch Mutationen in ihrem genetischen Material verursacht, was zu einer Zunahme der Anzahl von Multi-Arzneimittelpumpen auf der Oberfläche ihrer Zellen führt7,18.

Aufgrund der Tendenz von C. albicans, Antibiotikaresistenzen zu entwickeln, ist es notwendig, nach alternativen Präparaten zu suchen, die bei der Behandlung von Candidiasis eingesetzt werden können. Als Quelle für solche Stoffe kann die natürliche Umgebung genutzt werden, die seit Jahrhunderten die Naturheilkunde inspiriert. Regenwürmer sind Organismen, die in der traditionellen fernöstlichen Medizin seit langem zur Behandlung von Pilzinfektionen eingesetzt werden. Sie wurden auch zur Behandlung vieler anderer Krankheiten wie Gelbsucht oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen und zur Stärkung der Immunität eingesetzt19,20. Pasten, Pulver und Extrakte, die aus Regenwürmern und ihren Symbionten hergestellt werden, haben eine nachgewiesene Wirkung gegen Candida-Hefen und -Bakterien20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Zölomflüssigkeit von Regenwürmern, aus der Flüssigkeit abgetrennte Fraktionen und Extrakte dieser Wirbellosen zeigen ebenfalls gerinnungshemmende, entzündungshemmende und antitumorale Wirkung19,32,33.

Unsere Studien zeigten, dass der zuvor als Fraktion aus der Zölomflüssigkeit beschriebene Protein-Polysaccharid-Komplex keine zytotoxische Aktivität gegen normale menschliche Fibroblasten aufweist34. Der Venetin-1-Komplex zeigte Antitumoraktivität gegen nicht-kleinen Lungenkrebs35 und Dickdarmkrebs36 und übte eine thrombozytenaggregationshemmende Wirkung über mehrere Wege ohne Koagulopathie und Zytotoxizität aus37. Der Wirkstoff wurde aus der Zölomflüssigkeit des Regenwurms abgetrennt, nachdem seine Zytotoxizität durch Inkubation bei erhöhter Temperatur beseitigt worden war33. Nach diesem Vorgang blieb die Antitumor- und Antimykotika-Aktivität erhalten und gleichzeitig wurden normale Zellen geschont. Aus chemischer Sicht hatte das Präparat an jedem analysierten Punkt die gleiche Zusammensetzung und wurde in früheren Veröffentlichungen chemisch als Protein-Polysaccharid-Verbindung und Mikropartikel mit den Abmessungen 58,23 ± 3,93 nm34,35 charakterisiert.

Da der erhaltene Komplex, wie in früheren Publikationen gezeigt, auf die Zellwand und Membran von C. albicans einwirkt, schien es ratsam, diese Wirkung im Vergleich zum Standardantibiotikum zu analysieren, das ebenfalls mit der Zellmembran des Pilzes interagiert. Angesichts der zunehmenden Antibiotikaresistenz von Mikroorganismen legen die Ergebnisse von Studien zur antimykotischen Aktivität des Komplexes nahe, dass der Komplex aus Zölomflüssigkeit ein wertvolles Präparat im Kampf gegen Krankheiten sein könnte, die durch Pilze der Gattung Candida verursacht werden.

In dieser Forschung wurden Regenwürmer vom Typ Dendrobaena veneta verwendet. Diese Wirbellosen wurden unter überwachten Bedingungen in der Abteilung für Immunbiologie der Maria-Curie-Skłodowska-Universität in Lublin (Polen) aufgezogen. Die Ringelwürmer wurden in Behältern mit einem Fassungsvermögen von 3 Litern aufbewahrt. Die Behälter wurden mit Komposterde gefüllt und im Dunkeln mit Luftstrom bei 25 °C und 70–80 % Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. Die Regenwürmer wurden dreimal pro Woche mit grünen Teeblättern, Zellulose und gekochtem Gemüse gefüttert. Für die Experimente wurden nur ausgewachsene Regenwürmer ausgewählt.

Mit Wasser gespülte Regenwürmer wurden 24 Stunden lang auf feuchtem Lignin gehalten. Die Zölomflüssigkeit (CF) wurde aus Gruppen von 10 Personen gewonnen, die in eine kleine Menge 0,9 % NaCl getaucht wurden, um die elektrische Leitfähigkeit aufrechtzuerhalten. Die Flüssigkeit wurde nach 1-minütiger Elektrostimulation mit einem Strom von 4,5 V gewonnen. Der erhaltene CF wurde zentrifugiert (6000 × g, 10 min), um die Coelomozyten abzutrennen. Der Überstand wurde dann durch 0,22-Millipore-Filter filtriert und 10 Minuten lang auf 70 °C erhitzt. Das zellfreie CF wurde dann in einen Dialysebeutel mit einem Cut-off von 12–14 kDa überführt und über Nacht bei 4 °C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Der sterile Komplex wurde in Eppendorf-Röhrchen überführt, lyophilisiert und bei –20 °C gelagert. Die Proteinkonzentration im Venetin-1-Komplex wurde mit der Bradford-Methode38 bestimmt.

Das für die mikrobiologische Analyse verwendete klinische Isolat des C. albicans-Wildtypstamms wurde von Prof. A. Kędzia von der Abteilung für orale Mikrobiologie der Medizinischen Universität Danzig gespendet. Vor den Experimenten wurde die Pilzkultur in flüssigem Sabouraud-Medium bei 28 °C vorgezüchtet. Nach 24-stündiger Inkubation wurden 30 µL der C. albicans-Kultur (107 KBE in der logarithmischen Wachstumsphase) in 150 µL YPD-armes Medium, ergänzt mit Streptomycinsulfat (Sigma), in einer Endkonzentration von 0,17 mg mL−1 gegeben Venetin-1 oder Fluconazol. Die in den Experimenten verwendeten Endkonzentrationen von Venetin-1 und Fluconazol betrugen 25, 50 und 100 µg mL-1 bzw. 5, 10 und 20 µg mL-1. Die Proben wurden 48 Stunden lang unter Schütteln bei 37 °C inkubiert.

Für die mikroskopische Analyse vorgesehene Zellkulturen wurden wie im Abschnitt „Vorbereitung einer C. albicans-Zellkultur mit Venetin-1 und Fluconazol“ der Materialien und Methoden beschrieben vorbereitet. Phasenkontrast-Lichtmikroskopanalysen wurden mit ungefärbten C. albicans-Zellen durchgeführt. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden vier Fluorochrome verwendet: Kongorot, Calcofluorweiß, Hoechst 33342 mit Propidiumiodidmischung und Rhodamin 123. Die Fluoreszenzmikroskopie-Analyse und die Phasenkontrastanalyse wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) durchgeführt. Alle in der Analyse verwendeten Anregungswellenlängen und visualisierten Strukturen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Calcofluor weiß (Fluka) bindet an Chitin in der Zellwand des Pilzes. Das Fluorochrom (20 %ige wässrige Lösung) wurde mit einer 1:1-Suspension der analysierten Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Dann wurden 2 µL der Suspension auf einen Objektträger übertragen und beobachtet. Die in allen Kulturen vorhandenen Aggregate wurden nach Analyse von 1000 Formen gezählt. Der Versuch wurde dreimal wiederholt. Die identifizierten Formen waren Einzelzellen, Dubletts, Tripletts, Vierlinge, Ketten, kleine Aggregate (< 10 Zellen), große Aggregate (> 10 Zellen) und Hyphen/Pseudohyphen.

Kongorot-Farbstoff (Sigma-Aldrich) wurde verwendet, um β-1,4-Glucane 1,- der Zellwand sichtbar zu machen. Eine wässrige Lösung (2 %) des Farbstoffs wurde mit der Suspension der analysierten C. albicans-Zellen im Verhältnis 1:1 gemischt. Nach 3-minütiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurden 2 µL des Präparats auf einen Objektträger übertragen und beobachtet.

Eine Färbemischung aus Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) und Propidiumiodid (Sigma-Aldrich) wurde hergestellt und im Verhältnis 1:1 zu den Pilzkulturen gegeben und dann 5 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. 2 µL der Zellsuspension wurden unter dem Mikroskop analysiert. Die Farbstoffe wurden zur Visualisierung des genetischen Materials der Zellen in ihrem aktuellen Zustand verwendet: Normale Zellen zeigten eine blaue Fluoreszenz der Kerne, apoptotische Zellen zeigten eine hellweiße Fluoreszenz fragmentierten genetischen Materials und nekrotische Zellen zeigten eine rote Fluoreszenz39,40.

Der Farbstoff Rhodamin 123 (ThermoFisher Scientific) wird zum Färben von Membranen ordnungsgemäß funktionierender Mitochondrien verwendet. Aktive Mitochondrien weisen grüne Fluoreszenz auf. Zellen mit gestörter Mitochondrienfunktion haben kein Membranpotential und emittieren keine Fluoreszenz. Rhodamin 123 wurde in zwei Konzentrationen verwendet: 120 µg mL-1 für die Kontrollzellen und Kulturen, die mit Venetin-1 inkubiert wurden, und 30 µg mL-1 für mit Fluconazol behandelte Zellen. Die Verwendung der niedrigeren Dosis des Farbstoffs für Fluconazol hing mit der erhöhten Permeabilität der Zellwand von C. albicans nach einer Antibiotikabehandlung zusammen. Die Negativkontrolle wurde mit Natriumazid durchgeführt, einem Inhibitor des mitochondrialen Atmungswegs41. Eine 1,3 %ige Natriumazidlösung (Sigma) wurde mit den Kontrollzellen im Verhältnis 1:1 für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Pilzzellen, dh die Negativ- und Positivkontrolle sowie mit Fluconazol und Venetin-1 behandelte Zellen, wurden mit Rhodamin 123 in unterschiedlichen Konzentrationen 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und anschließend dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Proben wurden auf Objektträger übertragen und beobachtet.

Die Kontrollkulturzellen und die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL-1 behandelten Zellen wurden zentrifugiert (Raumtemperatur, 6000 × g, 10 min) und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 200 µL einer GH-Lösung (bestehend aus Glucose, HEPES und sterilem Wasser) suspendiert und erneut zentrifugiert. Dann wurde der Überstand entfernt und 20 µL der GH-Lösung hinzugefügt. Anschließend wurden die Zellen für 12 Minuten in eine Sublimationskammer mit einer Temperatur von –92 °C überführt. Danach wurden die gefrorenen Kulturen in der Vorbereitungskammer geschnitten und mit einem ZEISS Ultra Plus Feldemissionsmikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) mit Elektronenhochspannung (EHT) 5 kV und unter Vergrößerung 30.000 × 39,42 analysiert.

Zellkulturen, die wie im Abschnitt „Vorbereitung einer C. albicans-Zellkultur mit Venetin-1 und Fluconazol“ im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben hergestellt wurden, wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und 2500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 70 µL einer Fixierlösung (10 ml Phosphatpuffer pH = 7, 10 ml Glutaraldehyd 10 %, 200 mg Saccharose) suspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Fixierlösung verworfen und 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 7, zugegeben. Nach der Zentrifugation (2500 xg, 30 min, Raumtemperatur) wurde eine 1,5 %ige OsO4-Lösung zugegeben und mit den Zellen 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Pilzzellen zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend wurden die Kulturen mit Phosphatpuffer gewaschen und zentrifugiert. Die auf diese Weise hergestellten Zellen wurden in einer Reihe von Acetonverdünnungen (15 %, 30 %, 50 %, 70 %, 100 %) dehydriert, auf REM-Tische mit Kohlenstoffscheiben übertragen und in einem Exsikkator 24 Stunden lang in Gegenwart von Aceton getrocknet geröstetem Silikongel (für 2 h bei 180 °C). Anschließend wurden die Tische mit den Sonden mit einer K550X-Sputtermaschine (Quorum Technologies, Vereinigtes Königreich) mit einer Goldschicht beschichtet und mit einem Rasterelektronenmikroskop Tescan Vega 3 (Tescan Orsay Holding, Tschechische Republik)39 beobachtet.

Die in unserer Forschung verwendete Durchflusszytometrie-Analyse ermöglichte die Unterscheidung zwischen lebenden, apoptotischen und toten Zellen. Die Zellkulturen wurden für die Analyse vorbereitet, wie im Abschnitt „Vorbereitung einer C. albicans-Zellkultur mit Venetin-1 und Fluconazol“ unter „Materialien und Methoden“ beschrieben. Anschließend wurden 20 µL der Zellkultursuspension zu 780 µL ViaCount-Reagenz (Luminex, USA) gegeben und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die für ViaCount verwendeten Emissionsaufzeichnungskanäle waren rot und gelb. Für jede Probe wurden 5000 Zellen gezählt. Die Ergebnisse wurden mit der GuavaSoft-Software analysiert, wobei die Via-Zählungsbezeichnung und die Lebensfähigkeit mit dem EasyFit-Tool gezählt wurden, was die Unterscheidung lebensfähiger und apoptotischer Zellen ermöglicht, die einander überlappen. Die Durchflusszytometrie-Analyse wurde mit einem Guava easyCyte-Durchflusszytometer (Luminex, USA) durchgeführt.

Die durchflusszytometrische Analyse aktiver Mitochondrien in C. albicans-Zellen wurde unter Verwendung von Rhodamin 123 (Wasserlösung 20 µg mL−1) durchgeführt. Die wie im Abschnitt „Vorbereitung einer C. albicans-Zellkultur mit Venetin-1 und Fluconazol“ im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben hergestellte Zellsuspension wurde mit einer Fluorochromlösung gemischt und 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert41. Die für die Emissionsaufzeichnung verwendeten Kanäle waren Vorwärtsstreuung und Grün. Die Ergebnisse wurden mit dem InCyte-Programm analysiert. Die statistische Signifikanzanalyse wurde mit dem Statistica-Programm und dem HSD-Tuckey-Test durchgeführt.

Die FTIR-Spektroskopie ist eine der am häufigsten verwendeten Forschungstechniken zur Beobachtung der chemischen Struktur organischer und anorganischer Verbindungen. Es wird auch häufig bei der Untersuchung biologischer Systeme eingesetzt. Der Hauptvorteil der FTIR-Technik im Vergleich zu anderen spektroskopischen Methoden besteht darin, dass fast alle chemischen Verbindungen eine charakteristische Absorption von Strahlung im IR-Spektralbereich aufweisen; Daher können sie sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert werden43. Die Infrarotspektroskopie untersucht die Absorption von Strahlung, die mit der Anregung der Schwingungsniveaus von Molekülen einhergeht, was die Beobachtung von Veränderungen im Bereich chemischer Bindungen erleichtert. Um die Veränderungen in den C. albicans-Zellen nach der Behandlung mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL−1 und Fluconazol in einer Konzentration von 20 µg mL−1 zu beobachten, wurden FTIR-Spektren der vorbereiteten Proben aufgenommen . Die Tests wurden mit der ATR-Technik direkt von der Probenoberfläche bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Spektrometer wurde mit einem Thermo Nicolet 8700 FTIR-Spektrometer mit einem Smart Orbit™ Diamant-ATR-Aufsatz aufgezeichnet, der mit einem DTGS-Detektor (Deuterated Triglycine Sulfate) ausgestattet war. Die Spektren wurden im mittleren Infrarotbereich aufgenommen: 4000–650 cm−1 mit einer spektralen Auflösung von 4 cm−1. Die erhaltenen Spektren wurden einer Basislinienkorrektur und einer skalierten Normalisierung unterzogen.

Die Calcofluor-Weißfärbung, die zu einer intensiven Leuchtkraft der Zellwand führte, unterschied verschiedene Aggregate in der Kultur von C. albicans-Zellen (Abb. 1). C. albicans-Zellen wurden mit Venetin-1 und Fluconazol in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert; Anschließend wurden die einzelnen Aggregate gezählt und ihr Prozentsatz ist in Abb. 2 dargestellt. Die Anzahl der Einzelzellen sank von 43,72 % in der Kontrollkultur auf 17,61 % in der mit Venetin-1 bei einer Konzentration von 100 µg mL−1 inkubierten Kultur und auf 10,79 % in der Kultur, die mit Fluconazol in einer Konzentration von 10 µg mL−1 behandelt wurde. In der mit Fluconazol (bei einer Konzentration von 5 µg mL−1) inkubierten Kultur wurden doppelt so viele Pilztriplets beobachtet wie in der Kontrollkultur, nämlich 8,96 % bzw. 4,70 %. Außerdem wurden in den Kulturen, die sowohl mit Venetin-1 als auch mit Fluconazol inkubiert wurden, weniger Vierlinge gebildet. Der Prozentsatz kleiner Aggregate (bestehend aus weniger als 10 Zellen) unterschied sich nicht zwischen der Kontrollkultur und den mit Venetin-1 und Fluconazol behandelten Kulturen. Es wurde ein signifikanter Anstieg der Bildung großer Aggregate (bestehend aus 10 Zellen und mehr) beobachtet, von 4,7 % in der Kontrollkultur auf 18,24 % in der Kultur, die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL-1 inkubiert wurde. Auch der Prozentsatz der gebildeten Ketten in der mit Fluconazol (20 µg mL−1) inkubierten Zellkultur veränderte sich im Vergleich zur Kontrollkultur (von 1,34 auf 17,14 %). Ein signifikanter Anstieg der Anzahl der Hyphen/Pseudohyphen wurde auch nach der Inkubation mit beiden Präparaten beobachtet und erreichte 4,7 % in der Kontrollkultur, 30,19 % in der mit Venetin-1 (bei 100 µg mL−1) inkubierten Kultur und 22,86 % danach die Inkubation mit Fluconazol (bei 20 µg mL−1) (Abb. 1).

Bilder von Aggregaten von C. albicans-Zellen nach der Färbung mit Calcofluor White: (A1)–(A2)-Kontrollzellen von C. albicans; (B)- C. albicans-Zellen nach Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1; (C)- C. albicans-Zellen nach Inkubation mit Fluconazol bei 20 µg mL-1. Der Maßstabsbalken repräsentiert 5 µm.

Arten von Aggregaten in der Kontrollkultur von C. albicans und Kulturen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Venetin-1 und Fluconazol inkubiert wurden. Die im oberen Bereich dargestellten Farben entsprechen den Farben in den Kreisdiagrammen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 2 µm.

Die Kongorot-Färbung der Kontrolle zeigte, dass die Zellen rund oder oval waren und eine leichte rote Fluoreszenz der Zellwand aufwiesen (Abb. 3 IA). Die nach der Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 25 µg mL-1 beobachteten Zellen waren größer und zeigten eine stärkere Fluoreszenz (Abb. 3 IB). Bild IC zeigt Veränderungen in der Zellform sowie eine Zunahme ihrer Größe nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1 (Abb. 3 IC). Nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 wurden auf der gesamten Zelloberfläche nicht getrennte Zellen und rote Fluoreszenz beobachtet (Abb. 3 ID). Die Kulturen, die einer Behandlung mit Fluconazol in Konzentrationen von 5 und 10 µg mL-1 unterzogen wurden, zeigten Veränderungen in Form und Größe der Zellen und verzweigten Ketten nicht getrennter Zellen mit hellerer Fluoreszenz als in den Kontrollkulturen (Abb. 3 I E - F). Mit Fluconazol bei 20 µg mL−1 inkubierte Kulturen wiesen zusätzlich fluoreszierende Verbindungen zwischen den kettenbildenden Zellen auf (Abb. 3 IG). Darüber hinaus waren in dieser Probe Pseudohyphen und Zellen mit Knospennarben sichtbar. Die Inkubation mit allen Fluconazol-Konzentrationen führte nicht zu einer stärkeren Fluoreszenz als nach der Verwendung von Venetin-1.

IC albicans-Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 und Fluconazol, gefärbt mit Kongorot-Farbstoff: (A) – Zellen der Kontrollkultur; (B) – Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 25 µg mL−1; (C) – mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1; (D) – mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1; (E) – Zellen nach der Inkubation mit Fluconazol bei 5 µg mL−1; (F) – mit Fluconazol bei 10 µg mL−1; (G) – mit Fluconazol bei 20 µg mL−1. Der Maßstabsbalken repräsentiert 10 µm. II. Kryo-REM-Bilder von C. albicans-Zellen; A–A1 – Zellen der Kontrollkultur, B–B1 – Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1. Der Maßstabsbalken repräsentiert 1 µm.

Zur Visualisierung der Zellwandoberfläche wurde die Cryo-SEM-Technik verwendet. Die Bilder in Abb. 3 II A, A1 zeigen die Oberfläche der Zellwand von C. albicans in der Kontrollkultur. Die Oberfläche war deutlich klumpig. Die Verwendung von Venetin-1 in der höchsten Konzentration (100 µg mL−1) hatte eine glättende Wirkung auf die Wandoberfläche, was auf eine Störung in der Struktur der Pilzwand hinweisen könnte (Abb. 3 II B, B1).

Die Verwendung der Mischung aus Hoechst 33342 und Propidiumiodid erleichterte die Unterscheidung zwischen normalen, apoptotischen und nekrotischen Zellen. Normale Zellkerne zeigten blaue Fluoreszenz und hatten eine regelmäßige Form. Apoptotische Zellen hatten fragmentiertes genetisches Material mit heller weiß-blauer Fluoreszenz, während nekrotische Zellen durch die rote Farbe des Kernmaterials gekennzeichnet waren.

Die Kontrollzellen von C. albicans hatten ovale Kerne mit blauer Fluoreszenz (Abb. 4 I A1–A3 und II A1–A3). Die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1 behandelten Zellen wiesen genetisches Material auf, das über die Verbindungsstelle zweier Zellen, also Eltern- und Tochterzellen, verteilt war, was auf Störungen im Zellteilungsprozess schließen lässt (Abb. 4 I B1–B3, markiert). mit gelben Pfeilen). Die Zellen zeigten nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 eine unvollständige Trennung der Zellen voneinander, wie durch die weißen Pfeile in Abb. 4 I C1–C3 angezeigt. Apoptotische Zellen mit fragmentiertem Kern sind in Abb. 4 I C1–C2 dargestellt und durch einen orangefarbenen Pfeil gekennzeichnet.

C. albicans-Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 und Fluconazol, gefärbt mit einer Mischung aus Hoechst 33342 und Propidiumiodid-Farbstoffen; I-A1–A3 – Kontrollkulturzellen; B1–B3 – Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1; C1–C3 – mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1; II- A1–A3 – Kontrollkulturzellen, B1–B3 – Zellen nach der Inkubation mit Fluconazol bei 10 µg mL-1, C1–C3 – mit Fluconazol bei 20 µg mL-1. Die gelben Pfeile deuten auf ungetrenntes genetisches Material der Zellen nach der Zellteilung hin; die weißen Pfeile zeigen eine unvollständige Trennung der Zellen nach der Teilung an; Orangefarbene Pfeile zeigen apoptotische Zellen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 5 µm.

Die Zellen zeigten nach der Behandlung mit Fluconazol ebenfalls eine unvollständige Trennung, was zur Bildung von Ketten führte, wie durch die weißen Pfeile sowohl bei 10 µg mL−1 (Abb. 4 II B1–B3) als auch bei 20 µg mL−1 (Abb. 4) angezeigt II C1–C3). Der orangefarbene Pfeil in Abb. 4 II B2 zeigt den Kern einer apoptotischen Zelle an.

Die präsentierten Bilder zeigen die Auswirkung einer gestörten Zellteilung nach der Anwendung von Venetin-1 und Fluconazol; Störungen in der Kernmaterialtrennung während der Zellteilung wurden jedoch erst nach der Venetin-1-Gabe beobachtet. Nach der Anwendung von Fluconazol bildeten die Zellen Ketten, in der interzellulären Verengung wurde jedoch kein genetisches Material beobachtet. Diese Beobachtungen deuten trotz ähnlicher mikroskopischer Beobachtungen auf einen unterschiedlichen Wirkmechanismus beider Präparate hin.

C. albicans-Zellen, die den Knospungsprozess durchlaufen, wurden auch mit den REM- und Kryo-REM-Mikroskopietechniken analysiert (Abb. 5). Ein Querschnitt der Kontrollkulturzellen ist in Bild Abb. 5A dargestellt. Es ist eine ordnungsgemäße Knospung zu erkennen, bei der das genetische Material vollständig zwischen den Eltern- und Tochterzellen getrennt ist (mit einem Quadrat markierter Bereich). Die Zellen, die der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1 unterzogen wurden, sind im Bild in Abb. 5B dargestellt. Dieses Foto zeigt unvollständig getrenntes genetisches Material zwischen der Elternzelle und der Tochterzelle (markiert mit einem weißen Rahmen), was den Bildern in Abb. 4I entspricht. Die REM-Bilder der Kontrollkultur zeigen eine normale Zellteilung mit einem deutlich sichtbaren Teilungsring (Abb. 5C). Das Bild in Abb. 5 D zeigt Hefezellen nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 mit unvollständiger Zelltrennung. Die REM-Bilder stimmen mit den mit der Cryo-SEM-Methode erhaltenen Bildern überein.

C. albicans-Zellen, abgebildet durch Cryo-SEM (A, B) und SEM (C, D): (A) – Querschnitt von knospenden C. albicans-Zellen aus der Kontrollkultur; (B) – Querschnitt der knospenden C. albicans-Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1; (C)-Zellen von C. albicans aus der Kontrollkultur; (D) – Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1. Der Maßstabsbalken repräsentiert 2 µm.

Die mit dem Farbstoff Rhodamin 123 durchgeführte Analyse machte die Mitochondrien der Kontrollzellen als kleine grüne Punkte sichtbar, die sich an der inneren Peripherie der Zellen befanden (Abb. 6A). Die mit Natriumazid inkubierten Zellen der Negativkontrolle emittierten keine beobachtbare Fluoreszenz (Abb. 6B1). Das Bild in Abb. 6 B2 entspricht dem Bild B1 des Durchlichtmikroskops. Nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 25 µg mL−1 wurden Zellen mit verlängerten Mitochondrien (Abb. 6C1–C2, markiert mit weißen Pfeilen) und Zellen mit normalen Mitochondrien (Abb. 6C1–C2, markiert mit gelben Pfeilen) beobachtet. Nach der Anwendung von Venetin-1 in einer Menge von 50 µg mL−1 wurden Mitochondrien häufig als lange, gefaltete, grün leuchtende Strukturen sichtbar, die das Zelllumen ausfüllten (Abb. 6D1–D2). Die Kultur, die der Wirkung von Venetin-1 bei 100 µg mL-1 ausgesetzt war, zeigte zusätzlich Zellen ohne innere Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass ihre Mitochondrien inaktiv waren (Abb. 6E1–E2, markiert mit roten Pfeilen). Zellen mit verlängerten Mitochondrien sind in denselben Bildern mit weißen Pfeilen markiert. Die Inkubation mit Fluconazol führte zu keinen signifikanten Veränderungen in der Größe oder Lokalisierung der Mitochondrien (Abb. 6F – H). Einige Zellen zeigten aufgrund der hohen Aufnahme des Fluorochroms, die durch die erhöhte Permeabilität der Zellmembran nach der Fluconazol-Behandlung verursacht wurde, eine intensive grüne Fluoreszenz.

Rhodamin 123-Färbung von C. albicans-Zellen. (A) – positive Kontrollzellen mit kleinen runden Mitochondrien; (B1)–(B2) – mit Natriumazid behandelte Negativkontrollzellen. Bild (B2) ist eine Visualisierung von Zellen im Durchlichtmikroskop, äquivalent zu Bild (B1) aus dem Fluoreszenzmikroskop. (C1)–(C2)–C. albicans-Zellen behandelt mit Venetin-1 bei 25 µg mL−1, (D1)–(D2) – mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1, (E1)–(E2) – mit Venetin-1 bei 100 µg mL− 1; (F)–C. Albicans-Zellen behandelt mit Fluconazol bei 5 µg mL-1, (G) – mit Fluconazol bei 10 µg mL-1, (H) – mit Fluconazol bei 20 µg mL-1. Gelbe Pfeile zeigen Zellen mit normaler Mitochondrienform; weiße Pfeile zeigen Zellen mit verlängerten Mitochondrien an; Rote Pfeile zeigen Zellen an, die aufgrund inaktiver Mitochondrien keine innere Fluoreszenz aussenden. Der Maßstabsbalken repräsentiert 10 µm.

Zur Analyse aktiver Mitochondrien mit Rhodamin 123 wurde Durchflusszytometrie verwendet. Die Ergebnisse sind in Abb. 7a dargestellt. Die oberen Punktdiagramme zeigen Unterschiede zwischen den Kulturen in geschlossenen Regionen: R1 – reguläre Zellen, R2 – Aggregate und R3 – Zellen mit aktiven Mitochondrien. In der R3-Region, die nicht in R1 enthalten ist, sind die Mitochondrien der Zellen abnormal. Der Prozentsatz aktiver Zellen (Gate R3) war in allen Kulturen ähnlich: 60,9 % in der Kontrollkultur, 64,34 % nach der Inkubation mit Venetin-1 (bei 100 µg mL−1) und 66,22 % bei der Behandlung mit Fluconazol (bei 100 µg mL−1). 20 µg mL−1). Ein signifikanter Unterschied wurde in der Anzahl der regulären Zellen nach der Behandlung mit Venetin-1 (36,1 %) im Vergleich zu den Kontrollkulturzellen (52,7 %) und den mit Fluconazol behandelten Zellen (57,64 %) festgestellt. Auch Veränderungen im R2-Gate waren deutlich sichtbar, mit Werten von 6,38 % in der Kontrollkultur, 8,42 % in den mit Venetin-1 behandelten Zellen und 0,22 % in der mit Fluconazol inkubierten Kultur.

(a) Durchflusszytometrie-Analyse aktiver Mitochondrien mit Rhodamin 123. Dot-Plots der Kontrollkultur, Zellen nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1 und in der Variante mit Fluconazol bei 20 µg mL-1. R1-Zellen mit regulären Mitochondrien; R2-Aggregate; R3-Zellen mit aktiven Mitochondrien. (b) Gated-Regionen nach Durchflusszytometrie-Analyse: R1-Zellen mit regulären Mitochondrien; R2-Aggregate; R3-Zellen mit aktiven Mitochondrien. Histogramme stellen das Profil der Zellkulturen in den geschlossenen Regionen dar. Grün – Kontrollprobe, rot – Zellen nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1, lila – Zellen, die Fluconazol bei 20 µg mL-1 ausgesetzt wurden.

Die seitliche Streuung bezieht sich auf die Komplexität oder Granularität der Zelle, einschließlich der Mitochondrien. Die Histogramme (Abb. 7b) zeigen unterschiedliche Profile in der mit Venetin-1 inkubierten Zellkultur, was darauf hindeutet, dass sich die Struktur der Mitochondrien nach der Behandlung mit dem Präparat verändert hat. Die Beobachtungen zeigten keine Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie nach der Fluconazol-Behandlung im Vergleich zur Kontrollpilzkultur.

Die Phasenkontrastmikroskopie ist eine nützliche Methode zur Beobachtung von Objekten, die keinen natürlichen Kontrast aufweisen, einschließlich Zellvakuolen. Das mikroskopische Bild der Kontrollzellen von C. albicans zeigte Zellen mit der korrekten ovalen Form (Abb. 8A1–A2). Die Zellen, die dem Venetin-1-Komplex in Konzentrationen von 25, 50 und 100 µg mL-1 ausgesetzt waren, waren durch vergrößerte Vakuolen gekennzeichnet, die sowohl in Blastokonidien- als auch in Hyphenzellen beobachtet wurden (Abb. 8B1–B2, C1–C2, D1–D2, veränderte Vakuolen sind durch Pfeile gekennzeichnet). Darüber hinaus waren veränderte Vakuolen zahlreicher und füllten den größten Teil der behandelten Zelle (Abb. 8B2, D1–D2). Fluconazol wiederum verursachte bei keiner der verwendeten Konzentrationen (5, 10, 20 µg mL−1) die Bildung vergrößerter Vakuolen in den C. albicans-Zellen, es gab jedoch Zellen mit zahlreichen Körnungen und einer im Vergleich dazu deutlich vergrößerten Größe die Kontrollzellen (Abb. 8E1–E2, F1–F2, G1–G2).

Phasenkontrastmikroskopie von C. albicans-Zellen. (A1)–(A2)–C. Albicans-Kontrollzellen; (B1)–(B2)–C. albicans nach der Inkubation mit Venetin-1 bei 25 µg mL−1; (C1)–(C2) – mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1; (D1)–(D2) – mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1; (E1)–(E2)–C. albicans nach der Inkubation mit Fluconazol bei 5 µg mL−1; (F1)–(F2) – mit Fluconazol bei 10 µg mL−1; (G1)–(G2) – mit Fluconazol bei 20 µg mL−1. Die Pfeile zeigen vergrößerte Vakuolen in C. albicans-Zellen nach der Wirkung des Venetin-1-Komplexes. Der Maßstabsbalken entspricht 5 µm.

Mithilfe der Durchflusszytometrie-Technik wurde die Lebensfähigkeit der mit Venetin-1 und Fluconazol behandelten Zellen analysiert (Abb. 9). Das Durchflusszytometriebild der Kontrollkulturzellen ist in Bild IA dargestellt; die Lebensfähigkeit wurde auf 76,68 % geschätzt. Die Bilder in Abb. 9B1–B3 zeigen Daten aus der Analyse der mit Venetin-1 inkubierten Zellkulturen in den Endkonzentrationen 25 µg mL−1 (Abb. 9a B1), 50 µg mL−1 (Abb. 9a B2). und 100 µg mL−1 (Abb. 9a B3). Der Prozentsatz apoptotischer Zellen betrug nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 25 µg mL−1 (Abb. 9a B1), 56,91 % bei 50 µg mL−1 (Abb. 9a B2) und 50,78 % bei 100 µg mL −1 (Abb. 9a B3). Das Bild in Abb. 9a B3 zeigt eine separate Gruppe toter Zellen. Die Punktdiagramme in Abb. 9a C1–C2 und C3 zeigen Daten, die nach der Analyse der mit Fluconazol inkubierten Zellen bei Konzentrationen von 5, 10 und 20 µg mL−1 erhalten wurden. Der Anteil apoptotischer Zellen stieg mit zunehmender Fluconazol-Konzentration und betrug in der mit Fluconazol bei 5 µg mL-1 inkubierten Zellkultur 22,11 %, bei 10 µg mL-1 26,88 % und bei 20 µg mL-1 58,41 %. Abbildung 9b zeigt die Gesamtzahl der Kontrollzellen und in den Kulturen, die den unterschiedlichen Konzentrationen von Venetin-1 und Fluconazol ausgesetzt waren. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen den behandelten und unbehandelten Zellen.

(a) Durchflusszytometriedaten von C. albicans-Zellkulturen: (A) – Kontrollzellkultur; (B1) – Zellkultur behandelt mit Venetin-1 bei 25 µg mL-1, (B2) – mit Venetin-1 bei 50 µg mL-1, (B3) – mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1; (C1) – Zellkultur behandelt mit Fluconazol in einer Menge von 5 µg mL−1; (C2) – mit Fluconazol bei 10 µg mL-1, (C3) – mit Fluconazol bei 20 µg mL-1. Die rote Farbe entspricht lebensfähigen Zellen und die schwarze Farbe zeigt apoptotische Zellen an. (b) Gesamtzahl der Zellen in den Kulturen. Kontrolle – Kontrollzellen von C. albicans; V25, V50, V100 – C. Albicans-Zellen, behandelt mit Venetin-1 bei 25, 50, 100 µg mL-1; FL5, FL10, FL20 – Zellen, die mit Fluconazol in einer Menge von 5, 10, 20 µg mL-1 behandelt wurden; *** P < 0,01 (HSD Tukey-Test).

Im FTIR-Spektrum wurden drei Spektralbereiche analysiert: im Bereich von 3200–2800 cm−1, 1720–1400 cm−1 und 1200–950 cm−1 (Abb. 10). Im FTIR-Spektrum wurden im Bereich von 3200–2800 cm−1 Signale beobachtet, die für Schwingungen charakteristisch sind, die Bindungen in Lipiden entsprechen. Im Bereich von 1720–1400 cm−1 wurden Peaks beobachtet, die den für Bindungen in Proteinen charakteristischen Schwingungen entsprachen, während im Bereich von 1200–950 cm−1 für Polysaccharide charakteristische Banden beobachtet wurden. Die Tests zeigten einen Anstieg der Signale im Bereich von 2800–3500 cm−1 nach der Behandlung der C. albicans-Probe mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 (Abb. 10). Ein deutlicher Signalabfall bei 900–1800 cm−1 wurde ebenfalls beobachtet. Bei der Behandlung der C. albicans-Probe mit Fluconazol 20 µg mL−1 wurde eine Abnahme der Signalintensität nur im Bereich von 1800–1200 cm−1 beobachtet. Basierend auf den Literaturdaten wurden ausgewählte Signale mit der Zuordnung charakteristischer chemischer Bindungen analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

FTIR-Spektrum für die C. albicans-Kontrollkultur (Kontrolle) und nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 (V100) und Fluconazol bei 20 µg mL−1 (FL20).

In früheren Studien wurde festgestellt, dass der aus der Zölomflüssigkeit von D. veneta gewonnene Komplex auf die Zellwand und Membran von C. albicans wirkt. Seine Wirkung wurde mit der von Fluconazol verglichen, dessen Wirkung wohlbekannt ist. Fluconazol ist ein Azol-Antimykotikum aus der Gruppe der Triazol-Derivate. Der Wirkungsmechanismus von Medikamenten, die zu dieser Gruppe synthetischer Verbindungen gehören, basiert auf der Hemmung des Enzyms, das für die Biosynthese von Ergosterol verantwortlich ist, einem der Bestandteile, die die Zellmembran von Pilzen bilden10,45. Diese Stoffwechselstörung erhöht die Durchlässigkeit der Zellmembran. Die Zellmembran verliert ihre Schutzfunktionen und die Zelle hört auf zu wachsen, was zum Absterben des Pilzes führt.

Die aktuellen Medikamente und Antibiotika werden gegen Krankheitserreger immer weniger wirksam. Dies hängt mit der Tatsache zusammen, dass Pilze eine Antibiotikaresistenz gegen häufig verwendete Medikamente wie Azole entwickeln46. Fluconazol ist ein Mittel der ersten Wahl in der antimykotischen Behandlung. Eine längere Einnahme oder zahlreiche Behandlungen mit diesem Antibiotikum können zu einer Candida-Resistenz führen47,48,49. Fluconazol wird zur Prophylaxe von Mykosen bei immungeschwächten Patienten eingesetzt, darunter Patienten auf Intensivstationen, Patienten nach Organtransplantationen sowie Patienten, die sich einer Chemo- und Strahlentherapie unterziehen. Es wurde berichtet, dass klinische C. albicans-Isolate in etwa 20 Jahren resistent gegen Fluconazol sind. 30–40 %50,51. Es hat sich gezeigt, dass ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer Antimykotika besteht, die Patienten mit einer C. albicans-Infektion verabreicht werden können.

Die natürliche Umgebung war schon immer eine Inspirationsquelle für die Suche nach Substanzen mit wohltuenden Eigenschaften. Sie kommen in allen Lebensbereichen vor: Bakterien und Pilze produzieren Antibiotika, während ätherische Öle und eine Vielzahl günstiger Moleküle aus Pflanzen gewonnen werden können45. Auch Tiere produzieren im Laufe ihrer Evolution verbesserte Stoffe, um sie vor Krankheiten zu schützen. Regenwürmer, die zu den am längsten lebenden Tieren auf der Erde gehören, sind solche Organismen.

In unseren früheren Studien34 haben wir C. albicans-Zellen beschrieben, die nach Einwirkung der Protein-Polysaccharid-Fraktion der Zölomflüssigkeit von Regenwürmern mit dem weißen Fluorochrom Calcofluor gefärbt wurden. Es wurde beobachtet, dass sich die Zellwand ungleichmäßig verfärbte, was auf eine unterschiedliche Dicke der Chitinschicht in der Zellwand von Hefezellen hindeutet, die mit dem Wirkstoff behandelt wurden. In der vorliegenden Studie wurde auch die Bildung verschiedener Zellaggregate mikroskopisch abgebildet. Art und Menge der mehrzelligen Aggregate wurden sowohl nach der Inkubation mit dem Komplex als auch nach der Inkubation mit Fluconazol analysiert. Diese Analysen zeigten Unterschiede in der Anzahl der vielzelligen Formationen, was auf einen unterschiedlichen Wirkmechanismus gegen die Zellwand von C. albicans hinweist. Dies wurde auch durch die anderen Analysen bestätigt.

Bei den Analysen wurde gleichzeitig das Kongorot-Fluorochrom verwendet. Es kann mit (1,3)-β-Glucan einen Komplex bilden, der die Oberfläche von Pilzzellwänden unter einem Fluoreszenzmikroskop rot fluoreszieren lässt. Der Venetin-1-Komplex verursachte die Freisetzung von (1,3)-β-Glucan, während Fluconazol diese Zellwandkomponente nicht freilegte. Nur in den Teilungsnarben wurde eine leichte Fluoreszenz beobachtet. Es könnte mit dem von Pfaller und Riley52 beschriebenen Phänomen zusammenhängen, dass mit Fluconazol behandelte C. albicans-Zellen deutlich weniger Glucan in ihren Wänden enthalten. Zahlreiche Forschungsarbeiten haben die synergistische Wirkung verschiedener Verbindungen mit Fluconazol zur Freilegung der β-Glucan-Schicht untersucht47,53,54,55. In unserem Fall wurde diese Exposition erst nach der Einwirkung des Komplexes beobachtet, was durch Kryo-SEM bestätigt wurde. Die Abflachung der äußersten Schicht der mit Venetin-1 behandelten Zellen könnte auf eine Zerstörung der Mannoproteinschicht hinweisen, unter der sich die Schicht aus β-Glucanen befindet, was die nach der Verwendung des Kongorot-Fluorochroms beobachtete rote Fluoreszenz erklärt. Die Erkennung der β-Glucan-Komponente der Pilzzellwand ist ein Schlüsselelement des Immunsystems des Wirts. Daher können Verbindungen, die Glucan freisetzen, zu wertvollen Arzneimitteln werden53,56.

Die nach der Anwendung von Venetin-1 durchgeführten FTIR-spektroskopischen Tests von C. albicans zeigten eine Abnahme der Signalintensität im Bereich von 1720–1400 cm–1 und 1200–950 cm–1. Diese Banden entsprechen Schwingungen, die für chemische Bindungen in Proteinen und Polysacchariden charakteristisch sind, die Bestandteile der Zellwand von C. albicans sind. Die Abnahme der Intensität der für Proteine ​​charakteristischen Peaks kann auf eine Zerstörung der Mannoproteinschicht der Zellwand von C. albicans als Folge der Wirkung von Venetin-1 hinweisen. Es wurde auch eine Abnahme der Intensität der für Polysaccharide charakteristischen Signale beobachtet, die auch Bestandteil der Zellwand von C. albicans sind. Die Kryo-SEM-Bilder zeigten ebenfalls einen solchen Effekt der Zellwandzerstörung. Die FTIR-spektroskopischen Untersuchungen zeigten auch einen Anstieg der Intensität von Signalen, die den Schwingungen entsprechen, die für Bindungen in Lipiden charakteristisch sind. Dies bestätigt die Hypothese bezüglich der Zerstörung der Mannoproteinschicht und der β-Glucanschicht der Zellwand von C. albicans und der Freilegung der Lipidschicht der Zellmembran.

Die Wirkung des Komplexes auf die Zellwand und Membran von C. albicans-Zellen lässt sich bei der Analyse der Pilzzellen mittels Phasenkontrastmikroskopie erkennen, bei der Zellen mit unnatürlich vergrößerten Vakuolen beobachtet wurden, was auf Veränderungen der Membranpermeabilität schließen lässt. Nach der Inkubation der Pilzzellen mit Fluconazol wurde kein solcher Effekt beobachtet, was auf einen anderen Wirkmechanismus dieses Antibiotikums hinweist. Unter Berücksichtigung unserer früheren Studien, die zeigten, dass Lysenin und Lysenin-verwandtes Protein 2 die Hauptproteine ​​sind, die den Komplex bilden39, ist die Theorie über Veränderungen in der Zellmembranpermeabilität verständlich. Es ist bekannt, dass Lysenin-Proteine ​​hauptsächlich an der Abwehr sowohl eukaryontischer als auch prokaryontischer Krankheitserreger beteiligt sind. Lysenin bindet an den Membranrezeptor Sphingomyelin. Bei der Bindung an die Membran nach der Konformationsänderung wird das Oligomer in die Membran eingebaut57.

Zellteilungsstörungen wurden auch mit einer Mischung aus Hoechst- und Propidiumiodid analysiert, die das genetische Material markieren und apoptotische und nekrotische Zellen anzeigen kann. Bei der korrekten Teilung in der Stammzelle findet die mitotische Teilung des Zellkerns in zwei Zellen statt. Ein Kern diffundiert zusammen mit einem Teil des Zytoplasmas in die resultierende Ausbuchtung, die Knospe. Die Knospe wächst allmählich und wird durch die Zellwand von der Stammzelle getrennt. In den mit dem Zölomflüssigkeitskomplex behandelten Zellen wurde häufig eine unverteilte genetische Verteilung zwischen Mutter- und Tochterzelle beobachtet. Die Tochterzellen wuchsen ungeteilt aus der Mutterzelle hervor und das Kernmaterial war in der Verengung zwischen den Zellen sichtbar. Bei der Inkubation mit Fluconazol wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Die mit Venetin-1 behandelten und mittels Kryo-REM und REM abgebildeten Abschnitte von Pilzzellen zeigten eine unvollständige Zelltrennung während der Knospung, im Vergleich zu Kontrollzellen, bei denen die Zellwand und die Membran die Zellen während der Teilung deutlich trennten. Nach der Einwirkung des Komplexes wuchs die Tochterzelle zu einer großen Größe und konnte sich nicht mehr von der Mutterzelle lösen. Dadurch waren Zelldubletts mit einer Verengung zwischen den Zellen sichtbar. Dies weist auf eine abnormale Teilung des Kernmaterials bei gleichzeitiger Störung des Wand- und Membransystems hin. Die Zelle wuchs mit einem Mangel an Komponenten, die für die vollständige Teilung der Tochterzelle erforderlich waren. Mit Fluconazol behandelte C. albicans-Zellen teilten sich mit vollständiger Trennung des Kernmaterials zwischen den Zellen, was durch Literaturdaten bestätigt wird34.

Die nach der Rhodamin 123-Färbung erhaltenen Daten zeigten, dass die mit Venetin-1 behandelten C. albicans-Zellen deutlich sichtbare Veränderungen in der Mitochondrienform aufwiesen und durch einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials gekennzeichnet waren. Untersuchungen von Fiołka et al.39 zeigten, dass mit dem Komplex behandelte Pilzzellen einen erhöhten Anteil an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und einen höheren Anteil an Proteinen aufwiesen, die am ROS-Abbau beteiligt sind. Oxidativer Stress kann zu Schäden an DNA, Proteinen und Lipidverbindungen der Zellstrukturen führen58. Ein erhöhter ROS-Spiegel im Mitochondrium führt zur Öffnung von Ionenkanälen der Mitochondrienmembran und in der Folge zu einem Phänomen namens RIRR (ROS-induzierte ROS-Freisetzung), bei dem eine Störung des Mitochondrienmembranpotentials zu einer höheren Produktion von ROS beim Elektronentransport führt Kette59,60. Oxidativer Stress kann zu Apoptose oder Nekrose von Zellen führen, und nach der Behandlung von C. albicans mit Ventin-1 (zuvor als Zölomflüssigkeitsfraktion beschrieben) wurden beide Arten des Zelltods beobachtet34,39,60. Die mit Fluconazol behandelten C. albicans-Zellen zeigten bei der Rhodamin 123-Färbung keine Veränderungen in der Mitochondrienmorphologie. Die Wirkung auf Mitochondrien durch oxidativen Stress, der durch die Behandlung mit Fluconazol verursacht wird, beruht auf einer Beeinträchtigung ihrer Funktion durch Unterdrückung des mitochondrialen Elektronentransports, der reversibel ist61,62,63,64. Der zeitliche Verlust der Mitochondrienfunktion wird in der Literatur als Mechanismus der Fluconazol-Resistenz beschrieben62,65.

Sowohl der Venetin-1-Komplex als auch Fluconazol induzierten die Bildung mehrzelliger Aggregate; Allerdings ergab die Durchflusszytometrie Unterschiede zwischen den Zellkulturen. Die Analyse der Lebensfähigkeit von C. albicans wurde nur in Zellen durchgeführt, die keine großen Agglomerate oder komplexen mehrzelligen Strukturen bildeten, da das Design des Zytometers Analysen einzelner Zellen ermöglicht. Bei der Wirkung des Komplexes und der Wirkung von Fluconazol ist der Aggregatbildungseffekt jedoch ähnlich und die Ergebnisse der Durchflusszytometrie können miteinander verglichen werden, da in jedem Experiment identische Einstellungen der Analyse angewendet wurden.

Die mittels Durchflusszytometrie durchgeführte Analyse aktiver Mitochondrien zeigte Unterschiede zwischen mit Venetin-1 und Fluconazol behandelten Zellkulturen. Trotz ähnlicher Mengen an Zellen mit aktiven Mitochondrien verringerte die Behandlung mit dem Zölomflüssigkeitskomplex den Anteil regulärer Zellen. Dies weist darauf hin, dass Venetin-1 Veränderungen in den Mitochondrien verursachte, Fluconazol jedoch nicht. Dies legt nahe, dass sich der Wirkmechanismus von Venetin-1 von dem von Fluconazol unterscheidet. Die Ergebnisse der Zytometrie stützen die Beobachtungen der mit Rhodamin 123 gefärbten Zellen, die mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht wurden, insbesondere die Verlängerung der Mitochondrien in den mit Venetin-1 behandelten Kulturen und keine sichtbare Wirkung auf die Mitochondrien nach der Inkubation mit Fluconazol.

Die mittels Durchflusszytometrie durchgeführte Zelllebensfähigkeitsanalyse zeigte einen ähnlichen Anteil apoptotischer Zellen in den Kulturen, die mit Venetin-1 bei 100 µg mL-1 und Fluconazol bei 10 µg mL-1 inkubiert wurden. Die in diesem Experiment gewonnenen Daten zeigten auch, dass die höchste Konzentration von Venetin-1 einen nekrotischen Zelltod verursachte, der nach der Fluconazol-Behandlung nicht beobachtet wurde. Beide Präparate reduzierten die Zellzahl im Vergleich zur Kontrollkultur deutlich.

Bei der Suche nach neuen Therapeutika zur Behandlung von Infektionskrankheiten ist das Hauptproblem die fehlende Zytotoxizität, die ihre Anwendbarkeit einschränken würde. Im Fall von Fluconazol gibt es Berichte über seine Hepatotoxizität und Neurotoxizität66,67 sowie über zytotoxische und genotoxische Wirkungen auf die Nierenzelllinie von Affen68 und kultivierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes des Menschen69. Unsere früheren Untersuchungen wiederum deuten darauf hin, dass wärmebehandelte D. veneta-Zölomflüssigkeit und Venetin-1 keine zytotoxischen Wirkungen gegen menschliche Fibroblasten70, normale menschliche Dickdarmepithelzellen (CCD 841 CoTr)36, menschliches plättchenreiches Plasma37 und menschliche Bronchien haben Epithelzellen (BEAS-2B)35. Bei der Suche nach neuen Therapeutika für den Einsatz in der Medizin sollte man nicht nur die wirksame Wirkung und das Fehlen von Zytotoxizität, die normale Zellen rettet, berücksichtigen, sondern auch die Kosten und die Effizienz der Methode zur Isolierung des Wirkstoffs. Unter Berücksichtigung dieser Anforderungen erfüllt der aus der Zölomflüssigkeit gewonnene Venetin-1-Komplex idealerweise die Anforderungen an einen Kandidaten für die biomedizinische Forschung. In weiteren Analysen wollen wir die Wirkung des Komplexes auf verschiedene Candida-Arten erforschen, die Struktur des Komplexes erforschen und seine Wirkung in einem lebenden Organismus im Mausmodell analysieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das untersuchte Regenwurmpräparat mit einem anderen Wirkmechanismus als dem eines typischen Antibiotikums Anlass zu weiteren Untersuchungen gibt, da es sich offenbar um ein vielversprechendes Antimykotikum handelt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Rohdaten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die vorgestellten Forschungsergebnisse wurden vom Projekt des Nationalen Wissenschaftszentrums Polen [2020/37/B/NZ7/00763] unterstützt.

Abteilung für Immunbiologie, Institut für Biowissenschaften, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Sylwia Wójcik-Mieszawska & Marta J. Fiołka

Abteilung für Zellbiologie, Institut für Biowissenschaften, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Kinga Lewtak

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Abteilung für funktionelle Anatomie und Zytobiologie, Institut für Biowissenschaften, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Jerzy Wydrych

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SWM und MJF verfassten den Haupttext des Manuskripts und bereiteten Venetin-1 für die Forschung vor; SWM bereitete die Durchflusszytometrie vor und erstellte Tabelle 1., Abb. 1, 2, 3 I, 6, 7, 9; MF vorbereitete Abb. 3. I, 4, 5; WSC erstellte spektroskopische Analyse und Abb. 10, Tabelle 2; KL vorbereiten Abb. 8; JW führte eine mikroskopische Analyse durch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Marta J. Fiołka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wójcik-Mieszawska, S., Lewtak, K., Sofińska-Chmiel, W. et al. Atypische Veränderungen in Zellen von Candida albicans, die mit dem Venetin-1-Komplex aus der Zölomflüssigkeit von Regenwürmern behandelt wurden. Sci Rep 13, 2844 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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Eingegangen: 21. November 2022

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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