Tragbares Ozon- und Antibiotika-Zusatztherapiesystem zur Behandlung von Gram | Beijing AgileLift Ventures Group Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13927 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die problematische Kombination aus einer steigenden Prävalenz von Haut- und Weichteilinfektionen und der wachsenden Zahl lebensbedrohlicher antibiotikaresistenter Infektionen stellt einen dringenden, ungedeckten Bedarf für die Gesundheitsbranche dar. Diese evolutionären Resistenzen entstehen durch Mutationen in den Zellwänden der Bakterien, die eine wirksame Verbreitung von Antibiotika verhindern. Gramnegative Bakterien sind aufgrund der natürlichen Resistenz gegen viele gängige Antibiotika aufgrund der einzigartigen Doppelschichtstruktur der Zellwand von besonderer Bedeutung. Das hier entwickelte System bietet eine Lösung für dieses Problem durch eine tragbare Therapie, die gasförmiges Ozon als Zusatztherapie zu topischen Antibiotika über einen neuartigen Verband mit medikamentenfreisetzenden Nanofasern (NFs) abgibt und nutzt. Diese Technologie erhöht die Empfindlichkeit gramnegativer Bakterien gegenüber gängigen Antibiotika drastisch, indem sie oxidatives Ozon verwendet, um durch die Bakterienzellwand erzeugte Resistenzen zu umgehen. Um eine einfache und effektive Anwendung der Zusatztherapie zu ermöglichen, wurden Ozonabgabe und topische Antibiotika in einem einzigen Anwendungspflaster integriert. Die Wirkstofffreisetzungs-NFs werden durch Elektrospinnen in einer sich schnell auflösenden PVA-Matte erzeugt, ohne dass die Gasdurchlässigkeit des Verbands abnimmt. Eine systematische Studie ergab, dass die Ozonerzeugung bei 4 mg/h optimale Ozonwerte für eine hohe antimikrobielle Leistung bei minimaler Zytotoxizität liefert. Diese Ozonbehandlung wurde mit einer Zusatztherapie verwendet, die das System in vitro lieferte. Die Ergebnisse zeigten eine vollständige Ausrottung gramnegativer Bakterien mit Ozon und Antibiotika, die normalerweise nur für grampositive Bakterien verwendet werden. Dies zeigte die Stärke von Ozon als unterstützende Zusatzbehandlungsoption zur Sensibilisierung von Bakterienstämmen gegenüber ansonsten unwirksamen Antibiotika. Darüber hinaus wurde durch Biokompatibilitätstests gezeigt, dass die Behandlung keine zytotoxische Wirkung auf menschliche Fibroblastenzellen hat.

Im Gesundheitswesen sind Infektionen der Haut oder anderer Weichteile eine zunehmende Ursache für die Morbidität von Patienten. Diese Haut- und Weichteilinfektionen (SSTIs), die häufig Druckgeschwüre (PUs) oder diabetische Fußgeschwüre (DFUs) infizieren, sind Teil des großen globalen Marktes für Wundversorgung, der im Jahr 2022 auf 15 Milliarden US-Dollar geschätzt wird und auf über 15 Milliarden US-Dollar anwächst 22 Milliarden US-Dollar bis 20241. In den USA sind SSTIs die Ursache für 3,5 % der Notaufnahmebesuche, wobei Krankenhausaufenthalte die Patienten durchschnittlich 8.000 US-Dollar pro Aufenthalt kosten2,3. Es wird erwartet, dass diese Zahlen in den kommenden Jahren aufgrund der Verbreitung chronischer Erkrankungen wie Diabetes und einer alternden Bevölkerung noch weiter steigen werden. In den USA leiden 34,2 Millionen Menschen (ungefähr 10 % der Bevölkerung) an Diabetes4,5. Weltweit wird geschätzt, dass jedes Jahr etwa 2 % der Erwachsenen mit Diabetes eine DFU entwickeln, was zu 9,1 Millionen Fällen pro Jahr führt, wobei etwa die Hälfte aller DFUs infiziert wird6,7,8,9. Solche Infektionen führen häufig zu einer verminderten Wundheilung und anderen Erkrankungen wie Osteomyelitis, systemischen Infektionen, einem erhöhten Amputationsrisiko und dem Tod10,11,12,13.

Die typische Behandlung von SSTI-Infektionen, einschließlich solcher bei PUs und DFUs, umfasst die Verabreichung von Antibiotika. Diese Behandlungsmethode kann zwar in vielen Fällen die Bakterienbelastung reduzieren, trägt jedoch nicht zur Förderung einer frühen Wundheilung bei. Darüber hinaus ist die bakterielle Resistenz gegen Antibiotika ein wachsendes globales Problem, das die Wirksamkeit aktueller Behandlungsmethoden weiter einschränkt14,15,16. Gramnegative (G − ve) Bakterien weisen eine natürliche Resistenz gegen viele Antibiotikabehandlungen auf, da eine zusätzliche äußere Membran in der Zellstruktur viele Antibiotika daran hindert, ihr beabsichtigtes Ziel innerhalb der Zelle zu erreichen, und leichter verändert werden kann, um neue Resistenzen zu entwickeln17,18 . Dies hat zu einem solchen Anstieg der Anzahl und Schwere multiresistenter G − ve-Bakterien geführt, dass die Weltgesundheitsorganisation (WHO) nur G − ve-Bakterien in ihre Liste der antibiotikaresistenten Stämme aufgenommen hat, die am dringendsten behandelt werden müssen18. Dieses Problem ist umso alarmierender, als die Entwicklung und Zulassung neuer antimikrobieller Wirkstoffe zur Behandlung multiresistenter G − ve-Krankheitserreger nicht mit der anhaltenden Entstehung neuer Resistenzen bei Bakterien Schritt gehalten hat. Dies ist auf den langen, teuren und risikoreichen Prozess der Arzneimittelentwicklung zurückzuführen, der den Anreiz zur Produktion beeinträchtigt und die mühsame Aufgabe der behördlichen Zulassung für den Markt übersteht19. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Behandlungsmöglichkeiten für SSTIs.

Dieser große Bedarf hat zur Untersuchung einer Reihe alternativer Therapien geführt, die gegen Infektionen eingesetzt werden könnten, die durch virulente G − ve-Bakterienstämme verursacht werden. Zu den beliebtesten zählen die Verwendung von kaltem atmosphärischem Plasma (CAP), metallischen Nanopartikeln (NPs) und gasförmigem Ozon. Frühere Untersuchungen mit CAP haben gezeigt, dass die erzeugten ionisierten Partikel ermutigende antimikrobielle Eigenschaften aufweisen und auch zur Förderung von Heilungsfaktoren in der Wunde beitragen. Leider sind für den Betrieb dieser Systeme spezielle Geräte und geschultes Personal erforderlich, was den Einsatz der Technologie für häufige Behandlungen verbietet20,21. Metallische NPs, beispielsweise solche aus Kupfer und Silber, wurden aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Eigenschaften ebenfalls ausführlich untersucht. Obwohl auf Nanopartikeln basierende Metalle ein breites Anwendungsspektrum in der topischen Wundtherapie gefunden haben, ist ihr Hauptnachteil die hohe Toxizität für natürliches Gewebe22,23,24. Noch alarmierender sind die Berichte, dass einige G − ve-Bakterienstämme Resistenzen gegen Silber bilden25. Darüber hinaus werden antimikrobielle Pflaster mit neuartigen Materialien wie Chitosan für Mikronadelpflaster und Nanofasermatten entwickelt. Diese Pflaster werden als Verabreichungsmethode für Wundheilungsfaktoren und antimikrobielle Substanzen verwendet, um die Wundgesundheit zu fördern26,27,28,29. Während solche Systeme und Plattformen neue Wege für eine effektivere und tiefere Verabreichung von Therapeutika eröffnet haben, verfügen sie oft über eine begrenzte Menge an Medikamenten, was sie für häufige Anwendungen bei chronischen Wunden unpraktisch macht30. Darüber hinaus nutzen diese Systeme immer noch gängige Antibiotika und Nanopartikel, deren Einsatzmöglichkeiten aufgrund bakterieller Resistenz bzw. Zytotoxizität jedoch weiterhin begrenzt sind. Gasförmiges Ozon hingegen hat sich seit vielen Jahren als wirksame, sichere und zugängliche alternative Behandlung erwiesen. Studien haben gezeigt, dass topisch angewendetes gasförmiges Ozon ein breites Spektrum schädlicher Mikroorganismen, darunter Bakterien, Viren, Pilze und mehr, wirksam eliminiert31. Dies ist auf seine von Natur aus starken oxidativen Tendenzen zurückzuführen, die dazu führen, dass die äußere Membran der Bakterienzelle durch aufgebrachten oxidativen Stress geschwächt wird31. Der historische Erfolg von Ozon als antimikrobielles Mittel hat zu einer Vielzahl von Studien für klinische Anwendungen geführt. Viele der In-vitro-Tests konzentrierten sich auf die Verwendung hoher Ozonkonzentrationen (0,6–20 μg/ml). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ozon bei solchen Konzentrationen in der Lage ist, Bakterien innerhalb sehr kurzer Einwirkungszeiten zu eliminieren32,33. Ein weiterer untersuchter Vorteil von Ozon ist seine Fähigkeit, die frühe Wundheilungsaktivität in Zellen zu stimulieren, die auch mit der Anwendung von oxidativem Stress zusammenhängt34,35,36,37,38,39. Obwohl hochkonzentrierte Behandlungen Infektionen schneller behandeln können, erfordern sie auch spezielle Geräte und Einrichtungen und können durch Überbelichtung gesundes Gewebe schädigen. Allerdings haben Fortschritte bei elektronischen Systemen und Leistungsfotosystemen die Möglichkeit geschaffen, durch miniaturisierte Koronaentladungssysteme Ozon in relativ geringerer Konzentration zu erzeugen. Solche Systeme können die einzigartige Möglichkeit bieten, mit einem tragbaren Erzeugungsansatz nachhaltigere und niedrigere Ozonwerte an der Zielwunde bereitzustellen, wodurch der Bedarf an Spezialausrüstung und geschultem Personal entfällt und das Risiko einer Schädigung gesunder Zellen erheblich verringert wird32,40.

Zusätzlich zur Verwendung der Ozontherapie als eigenständige Behandlung wird vorgeschlagen, dass die Kombination von Ozon als Zusatztherapie mit aktuellen Antibiotika die Leistung beider Therapien erheblich verbessern würde, insbesondere gegen resistente Stämme von G − ve-Bakterien. Der Einsatz einer Zusatztherapie zur Steigerung der Antibiotikawirksamkeit wurde bereits zuvor mit Elektroporation, chemischer Photosynthese reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und intraperitonealer Ozoninjektion untersucht41,42,43. Die erhöhte Wirksamkeit von Antibiotika in solchen Kombinationstherapiesystemen wurde durch den Prozess der erhöhten Diffusion von Antibiotika in die Bakterienzellen durch die Sekundärbehandlung erklärt, wodurch die äußere Membran der Bakterienzellen geschädigt wird. Obwohl diese Methoden erste positive Ergebnisse gezeigt haben, gibt es bei jeder Methode erhebliche Einschränkungen, einschließlich einer begrenzten Eindringtiefe aufgrund der Zytotoxizität der Elektroporation, der für die Photogenerierung von ROS erforderlichen chemischen Synthese und des invasiven Verfahrens zur Ozoninjektion. Topisches Ozon, das über ein tragbares Pflaster angewendet wird, kann die gleichen synergistischen Eigenschaften bieten, indem es die Zellmembran oxidiert und Löcher schafft, durch die das Antibiotikum in die Zelle gelangen kann44. Diese Technik erzeugt wirksam einen synergistischen Effekt zwischen der Zusatz- und der Antibiotikatherapie. Ein zusätzlicher Vorteil solcher Behandlungen besteht darin, dass die geschädigten Bakterienmembranen die Zahl der verfügbaren antibiotischen Behandlungsmöglichkeiten erhöhen. Aufgrund der Verringerung der äußeren Membranabwehr, die den Hauptunterschied zwischen Gram-positiven (G + ve) und G − ve-Stämmen darstellt, wird erwartet, dass die zusätzliche Ozontherapie Antibiotika, die bei G + ve üblicherweise wirksam sind, ermöglichen wird Wirkt effektiv gegen G − ve Bakterienstämme. Der Einsatz von Ozon zur Umgehung intrinsischer oder entwickelter Antibiotikaresistenzen von G − ve-Bakterien wird den längeren Einsatz aktueller Antibiotikatechnologien ermöglichen. Die beiden kombinierten Therapien ermöglichen außerdem eine reduzierte Dosierung von Antibiotika und Ozon, wodurch die negativen gesundheitlichen Auswirkungen der Exposition gegenüber hochkonzentriertem Ozon begrenzt und die Entwicklung neuer Antibiotikaresistenzen verlangsamt wird.

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines neuartigen integrierten Therapiesystems zur topischen Verabreichung von Ozon und Antibiotika als Zusatzbehandlung infizierter Hautwunden, insbesondere solcher, die durch arzneimittelresistente G − ve-Bakterien verursacht werden und neuartige antimikrobielle Mittel erfordern. Dieses System besteht aus zwei Teilen: einer tragbaren Ozonerzeugungseinheit und einem Einweg-Applikationspflaster zur Kontaktierung mit der Wundoberfläche. Das Ozonerzeugungssystem enthält einen Ozongenerator mit geringem Stromverbrauch und ein Mikrogebläse, die über einen integrierten Akku und einen Mikrocontroller gesteuert werden und eine kontrollierte Ozonabgabe von 0 bis 4 mg/h ermöglichen. Das Wundpflaster verfügt über eine dreischichtige Struktur mit einer internen Diffusionsschicht, die eine gleichmäßigere Ozonanwendung durch physikalische Ausbreitung des Stroms durch die Poren ermöglicht, einer hydrophoben und gasdurchlässigen Membran zur Verhinderung der Flüssigkeitsaufnahme in den Verband und einem biologisch abbaubaren Material Arzneimittelfreisetzendes Netz aus Nanofasern (NF) für die topische Anwendung von Antibiotika45. Dadurch entsteht ein vollständig integriertes System, das eine topische Zusatztherapie von Antibiotika mit gasförmigem Ozon ermöglicht. Das Pflaster wird direkt auf die Wundstelle aufgetragen. Dort sollen die biologisch löslichen Polymerfasern bei Kontakt mit dem Wundbett zerfallen und die antibiotische Nutzlast topisch an die Wunde abgeben. Gleichzeitig wird gasförmiges Ozon von einem tragbaren externen Ozonerzeugungssystem durch das angebrachte Pflaster auf die Wundoberfläche gepumpt, wie in Abb. 1 dargestellt, wodurch eine zusätzliche antimikrobielle Wirkung erzielt und die antibiotische Wirkung durch eine erhöhte Diffusion aufgrund des oxidativen Anteils des Bakteriums verstärkt wird Membranen.

Tragbares Zusatzsystem für die Ozon- und topische Antibiotikatherapie. (a) Eine Ozon- und Antibiotika-Zusatztherapie kann als alternative Behandlung für Haut- und Weichteilinfektionen eingesetzt werden, die auf herkömmliche Therapien nicht ansprechen. Ozon hat antimikrobielle Eigenschaften und ermöglicht es Antibiotika, in die Zelle einzudringen und Zellfunktionen wie die Proteinproduktion zu stören. (b) Das System nutzt gasförmiges Ozon und eine gasdurchlässige und medikamentenfreisetzende Nanofasermatte zur Behandlung sich entwickelnder Wunden im folgenden Verfahren: (i) Ein All-in-One-Wundpflaster mit medikamentenfreisetzendem Nanofasernetz und gasdurchlässiger Membran wird auf die Haut aufgetragen Wunde. (ii) NFs beginnen sich aufzulösen und die topischen Antibiotika freizusetzen. (iii) Das System wird über die gesamte Behandlungsdauer mit Ozon beaufschlagt, da topische Antibiotika vollständig aus NFs freigesetzt werden. Ozon und Antibiotika wirken zusammen, um Infektionen zu beseitigen. (iv) Sobald die Wunde verheilt ist, wird das Wundpflaster aus dem Bereich entfernt. Durch die Kombination einer Ozon- und Antibiotikabehandlung können Antibiotikaresistenzinfektionen behandelt und die Entwicklung neuer Infektionen verhindert werden, was zu schnelleren Heilungszeiten führt.

Damit das System effektiv ist, wurden die folgenden technischen Kriterien berücksichtigt. Erstens ist die Portabilität des Systems wichtig, um sicherzustellen, dass Patienten über einen längeren Zeitraum Zugang zur Behandlung haben, ohne durch klinische Geräte oder unbewegliche Haltevorrichtungen eingeschränkt zu sein, sodass Patienten ihre Medikamente einfach und diskret zu Hause selbst verabreichen können, ohne sie zu beeinträchtigen ihren Lebensstil. Die tragbare Stromquelle kann einen einzelnen Generator mit einer Produktion von 0–4 mg/h oder zwei Generatoren mit einer Produktion von 0–8 mg/h Ozon betreiben. Um die optimale Ozonerzeugungsrate zu ermitteln, wurde eine systematische Untersuchung der antimikrobiellen und biokompatiblen Eigenschaften von Ozon bei unterschiedlichen Erzeugungsraten durchgeführt. Zweitens wurde das optimierte Ozonsystem in Kombination mit topischen Antibiotika getestet, um die synergistische Verbesserung der Behandlung von G − ve-Bakterien unter physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen. Diese Behandlungen konzentrierten sich auf die Verwendung von Ozon zur Sensibilisierung von G − ve-Bakterien gegenüber Antibiotika, die üblicherweise bei G + ve-Krankheitserregern eingesetzt werden. Da die Anwendung des gasförmigen Ozons und des Antibiotikums gleichzeitig möglich sein muss, stellt die typische topische Verabreichung von Antibiotika, beispielsweise einer Creme, eine Barriere für die Diffusion des Ozons dar. Daher verwendet das berichtete System eine Matte aus biologisch löslichen Nanofasern (NFs), um die Antibiotika topisch abzugeben. In dieser Studie haben wir zwei gängige Antibiotika zur Behandlung von G + ve-Infektionen, Vancomycin und Linezolid, als Wirksamkeitsnachweis ausgewählt. In der Studie konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Ozon und diesen Antibiotika zu einer deutlich erhöhten Wirksamkeit der Behandlung führt. Daher gibt es Grund zu der Annahme, dass Ozon eine wichtige Zusatzbehandlung ist, um zuvor resistenten Antibiotika neues Leben einzuhauchen. Darüber hinaus wurde das System für die Übertragung des Produkts durch klinische Studien auf den Markt entwickelt, indem kostengünstige Materialien (Kosten für Einwegpflaster: < 2,50 $) und eine topische Behandlungsmethode verwendet wurden, die im klinischen Umfeld einfach zu implementieren wäre37.

Um die topische Ozon- und Antibiotika-Wundtherapie zu ermöglichen, wurde ein Ozonerzeugungs- und -abgabesystem entwickelt (Abb. 2a). Das System verfügt über ein integriertes Ozonerzeugungssystem, das mithilfe einer Koronaentladung gasförmiges Ozon aus der Umgebungsluft erzeugt, sowie über ein Mikrogebläsesystem zur Abgabe des erzeugten Ozons. Eine eingebaute Batterie versorgte das System mit Schaltern zur Benutzersteuerung sowohl der Ozon- als auch der Gebläsefunktion. Das Design ermöglicht die Point-of-Care-Erzeugung und -Anwendung von Ozon über ein tragbares und wiederverwendbares System zur einfachen Integration in die aktuelle klinische Praxis. Die Ozonerzeugungsniveaus des Systems wurden charakterisiert, um den Ozonausstoß bei jeder Erzeugungseinstellung zu quantifizieren. Der Ausgang des Ozongenerators wurde über ein Mikrocontroller-Pulsweitenmodulationssignal (PWM) gesteuert und die Ozonkonzentration im Durchflussausgang wurde mit einem handelsüblichen Ozonsensor gemessen. Abbildung 2b zeigt die Ergebnisse der dreifach gemessenen Ozonkonzentration bei drei verschiedenen Massenerzeugungseinstellungen auf dem entwickelten tragbaren Ozonabgabesystem. Der Ozongehalt wurde bei 100 Teilen pro Million (ppm) für 2 mg/h, 132 ppm für 4 mg/h und 204 ppm für 8 mg/h gemessen. Dies zeigt, dass die Ozonkonzentration in ppm als Reaktion auf die Massenerzeugungsrate des Systems ungefähr linear ist, wenn ein Basislinien-Erzeugungsversatz von Ozon berücksichtigt wird. Dieses kontrollierbare Verhalten ermöglicht die Untersuchung optimierter Erzeugungsraten für die Anwendung der Ozonbehandlung.

Tragbares Zusatzsystem für die Ozon- und topische Antibiotikatherapie. (a) Ozon-Wundbehandlungssystem zur topischen Verabreichung einer zusätzlichen Ozon- und Antibiotikatherapie an Hautwunden. Das System besteht aus einem tragbaren Ozonerzeugungssystem mit Mikrogebläse zur Ozonabgabe und einem porösen Netz aus medikamentenfreisetzenden PVA-Nanofasern zur Antibiotikaabgabe. Das tragbare wiederaufladbare System ist in ein kundenspezifisches Gehäuse eingebaut und nutzt integrierte Elektronik mit geringem Stromverbrauch. (b) Verhältnis der durch tragbare Systeme erzeugten Ozonkonzentration zur Massenerzeugungsrate. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Das für dieses System entwickelte Zusatztherapiepflaster besteht aus drei Schichten: einer internen Dispersionsschicht zur Vergrößerung der Ozonabdeckungsfläche, einem hydrophoben Verband zur Verbindung mit der Wunde und einem biologisch abbaubaren, wirkstofffreisetzenden NF-Netz. Die innere Dispersionsschicht wurde aus einem porösen Polymernetz mit Porengrößen von 0,003 bis 0,02 mm2 (gemessen mit ImageJ aus Mikroskopbildern) hergestellt, um die Diffusion des Ozongases zu ermöglichen, bevor es durch den durchlässigen Verband in das Wundbett gelangt. Es wurde zuvor gezeigt, dass dies die Fläche und die Gleichmäßigkeit der Ozonabdeckung auf der Wundstelle deutlich vergrößert37. Die gasdurchlässige Membran wurde mit Polydimethylsiloxan (PDMS) behandelt, um Hydrophobie zu induzieren. Diese Behandlung verhindert die Aufnahme von Flüssigkeit in die Poren des Verbandes, was sich negativ auf die Ozondiffusion in das zu behandelnde Wundbett auswirken würde37. Da herkömmliche Methoden der topischen Anwendung von Antibiotika, wie z. B. Cremes, die Ozondiffusion hemmen, wurde das biologisch abbaubare NF-Netz verwendet. Dieses Netz wurde mithilfe eines Elektrospinnverfahrens aus Poly(vinylalkohol) (PVA) und einer Antibiotikalösung hergestellt. Dadurch konnten nanometergroße Polymerstränge in einer gasdurchlässigen, überlappenden Netzstruktur direkt auf dem Anwendungspflaster erzeugt werden.

Um die Struktur und Eigenschaften der NFs zu identifizieren, wurden Mikroskop- und Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen (REM) an den NFs durchgeführt, die durch den Elektrospinning-Prozess erzeugt wurden. Abbildung 3a–h zeigt die Bildergebnisse sowohl eines optischen Mikroskops (OM) als auch des SEM. Der Bildvergleich des PDMS-behandelten Verbandes vor und nach der NF-Anwendung und -Auflösung zeigt, dass durch die Ablagerung und Auflösung der arzneimitteleluierten NFs keine Strukturveränderung auftritt. Diese Eigenschaft wurde in den folgenden Charakterisierungen weiter bestätigt und quantifiziert. Betrachtet man die Bilder der auf dem Verband abgelagerten NFs, kann man schlussfolgern, dass das erzeugte Netz wiederum eine poröse Struktur aufweist. Die gemessene Fasergröße betrug 300 nm Durchmesser für die Fasern, die Vancomycin enthielten, und 100 nm Durchmesser für die Fasern, die Linezolid enthielten. Es wird erwartet, dass dieser Größenunterschied auf die größere Molekülgröße von Vancomycin zurückzuführen ist (1449,3 Da im Vergleich zu 337,3 Da für Linezolid)46,47.

Eigenschaften der elektrogesponnenen NF-Matte. Mikroskopbild von (a,e) der Oberfläche des Ozonabgabepflasters und (b,f) nach der Beschichtung mit Linezolid-haltigen NFs, (c,g) und nach der Beschichtung mit Vancomycin-haltigen NFs, (d,h) nach der Auflösung der NFs. Die Bilder wurden mit einem optischen Mikroskop (a–d) und einem REM (e–h) aufgenommen. (i) Histogramm, das die Häufigkeit der Porengröße in Vancomycin- und Linezolid-Spinnfasermatten zeigt. (j) Kontaktwinkelmessung des Verbandes in verschiedenen Behandlungsstadien. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Die weitere Analyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt (Abb. 3i). Die Größe der Poren innerhalb des elektrogesponnenen Netzes, das mit beiden Antibiotika erzeugt wurde, wurde gemessen. Die Daten wurden in einem Histogramm zusammengefasst. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwischen den Porengrößen in den einzelnen Maschen kaum Unterschiede bestehen, wobei beide einen Großteil der Poren (50,8 % für Vancomycin und 53,5 % für Linezolid) unter 0,025 μm2 aufweisen, obwohl das Linezolid-Netz einen größeren Anteil an Poren mit mehr als 0,025 μm aufwies 0,35 µm2 (4,1 % vs. 1,4 %). Dies weist darauf hin, dass die Porosität aufgrund der Faseransammlung zwischen den beiden Maschen ähnlich sein sollte, wobei etwaige Abweichungen auf die erhöhte Masse der abgelagerten Linezolidfasern zurückzuführen sind.

Die Hydrophobie/Hydrophilie des porösen Verbandes war auch für die topische Anwendung von Ozon wichtig. Eine hohe Hydrophilie der NF-Schicht beschleunigt die Flüssigkeitsinteraktion und führt zu einer schnellen Auflösung und Antibiotikaanwendung. Andererseits ist ein hohes Maß an Hydrophobie für den darunter liegenden Wundverband erforderlich, um die Flüssigkeitsaufnahme in die Poren des Verbandes abzuwehren, die die Ozonbewegung vom Pflaster in die Wundstelle verhindern würde. Aus diesem Grund wurde die hydrophobe Natur des Verbandes untersucht. Der Kontaktwinkel wurde an Verbandsproben vor der NF-Ablagerung, an Verbandsproben mit NF-Beschichtung und an Verbandsproben gemessen, nachdem die NFs vollständig von der Oberfläche gelöst waren. Der Kontaktwinkel der Probe entspricht der Hydrophobie. Wie in unserer vorherigen Arbeit beschrieben, wurden dem Verband durch eine verdünnte PDMS-Beschichtung auf den Fasern hydrophobe Eigenschaften verliehen37. Es wurde beobachtet, dass der Kontaktwinkel des mit PDMS behandelten Verbandes 135° vor der NF-Ablagerung und 140+° betrug, nachdem sich das NF vollständig von der Oberfläche gelöst hatte. Es ist auch zu erkennen, dass beide NFs mit Linezolid und Vancomycin viel geringere Kontaktwinkel haben, nämlich 0° bzw. 82°. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich das hydrophobe Verhalten des technischen Verbandes nicht ändert, nachdem die NFs von der Pflasteroberfläche gelöst wurden (Abb. 3j). Somit bleibt die gewünschte Hydrophobie des Pflasters über die gesamte Behandlungszeit erhalten, während die hydrophile Natur der NF-Schicht eine schnelle Auflösung durch erhöhten Flüssigkeitskontakt ermöglicht.

Eine weitere für die Gesamtleistung der Behandlung wichtige Eigenschaft ist die Porosität des Verbandes mit und ohne NF-Schicht, da die Porosität des Verbandes es dem gasförmigen Ozon ermöglicht, in den Wundbereich einzudringen und ihn lokal zu beeinflussen. Der Effekt der Netzporosität wurde durch Messung des inneren Strömungsdrucks quantifiziert, während eine konstante Durchflussrate durch den Verband gepumpt wurde. Der Zustand des Verbandes wurde variiert, um ihn zu verschiedenen Zeitpunkten im Behandlungsprozess zu charakterisieren.

Abbildung 4a zeigt den gemessenen Innendruck, während Luft mit Durchflussraten von 5 bis 25 ml/min durchgedrückt wurde. Zu den getesteten Proben gehören ein Basislinienfluss durch das System ohne Pflaster (offen), eine makellose Probe des hydrophoben Verbands (unbehandelt) sowie hydrophobe Verbandsproben mit NFs und nach NF-Auflösung. Es ist zu erkennen, dass bei keiner der Proben mit Ausnahme des Verbandes mit eingelagerten Linezolidfasern ein Anstieg des Strömungswiderstandes erkennbar ist. Der Strömungswiderstand erhöhte sich bei der höchsten Strömungsgeschwindigkeit um etwa 80 % (Abb. 4b). Dieser Anstieg war auf die Hinzufügung einer signifikanten Schicht medikamentenfreisetzender NFs zurückzuführen. NFs wurden so abgelagert, dass die Schicht auf dem Pflaster Antibiotika in einer Hemmkonzentration von 20 μg/cm2 enthielt. Unterschiedliche Löslichkeiten von Vancomycin und Linezolid führten zu einer dickeren Schicht von Linezolid-Fasern als von Vancomycin, da mehr Vancomycin in jede Faser pro Masseneinheit geladen wurde (0,1 Gew.-% Vancomycin gegenüber 0,03 Gew.-% Linezolid). Da viel mehr Linezolid-Fasern abgelagert werden als Vancomycin-Fasern (667 μg/cm2 gegenüber 100 μg/cm2 für Vancomycin), gab es trotz der im vorherigen Abschnitt diskutierten relativen Ähnlichkeit der Porengröße einen viel größeren Effekt auf den Widerstand gegen den Gasfluss. Dennoch behinderte selbst die erhöhte Porosität den Gasstrom nicht, da der Gesamteffekt aufgrund der porösen Netzstruktur der NFs, die in Abb. 3 zu sehen ist, verringert wurde. Darüber hinaus wurde die schnell auflösende Natur der Fasern (wie unten diskutiert) berücksichtigt. bedeutet, dass dieser vorübergehende Rückgang der Porosität voraussichtlich vernachlässigbar ist.

Porositätscharakterisierung von Ozonverbänden mit und ohne arzneimittelfreisetzender NF-Beschichtung. (a) Interner Strömungswiderstand bei unterschiedlichen Durchflussraten für den Verband in verschiedenen Anwendungsstadien. (b) Vergleich des internen Strömungswiderstands bei 25 ml/min. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Es gibt umfangreiche Forschungsarbeiten, die den Einsatz von NFs bei der Arzneimittelverabreichung mit einem breiten Spektrum an geplanten Freisetzungszeiten von Minuten bis Tagen bestätigen48,49,50,51,52,53,54,55,56. Die Charakterisierung der Auflösungszeit der NFs ermöglicht Einblicke in die Geschwindigkeit, mit der das aktive Antibiotikum zur Behandlung auf den Wundbereich aufgetragen wird, und in die Dauer, während der die Porosität des Verbandes im Fall von Linezolid-NFs reduziert wird. In diesem Fall ist es von Vorteil, dass das Antibiotikum schnell freigesetzt wird, um eine Interaktion mit Bakterienzellen zu ermöglichen, da die molekulare Aufnahme aufgrund der durch Ozon verursachten Poren in den Bakterienzellmembranen erhöht wird57,58. Um die Auflösungszeit zu charakterisieren, wurden NFs, die einen Farbstoff mit einem dem jeweiligen Antibiotikum ähnlichen Molekulargewicht enthielten, unter den gleichen Bedingungen wie Modelle für die Auflösung der wirkstofffreisetzenden NFs elektrogesponnen. Jede NF-Probe wurde auf die gewünschte Größe zugeschnitten und für eine festgelegte Dauer entionisiertem Wasser ausgesetzt. An den Flüssigkeitsproben wurden optische Absorptionsmessungen durchgeführt und mit dem Messwert einer vollständig gelösten Probe verglichen. Diese Daten wurden dann organisiert, um den Auflösungsprozentsatz über die Zeit anzuzeigen.

Vor der vollständigen Charakterisierung der Auflösungsrate wurde eine Studie durchgeführt, um zu verstehen, wie sich die Hydrolyse des zur Herstellung der Fasern verwendeten PVA auf die Löslichkeit auswirkt. Hydrolyse ist eine Eigenschaft von PVA, die den Grad angibt, in dem die Acetatgruppen während des Syntheseprozesses aus Polyvinylacetat entfernt werden59,60. Der Effekt der Hydrolyse wurde wie in Abb. 5a gezeigt getestet. Im Laufe der Zeit lösten sich vollständig hydrolysierte NFs nicht auf, während sich teilweise hydrolysierte Fasern schnell auflösten. Dies ist auf starke Wasserstoffbindungswechselwirkungen zurückzuführen, die verhindern, dass sich vollständig hydrolysierte Fasern unter 80 °C auflösen. Daher wurde das teilweise hydrolysierte PVA als optimal für schnell auflösende Fasern ausgewählt. Die Auflösung der NFs wurde dann sowohl für die Modell-Linezolid- als auch für die Vancomycin-NFs vollständig charakterisiert. Wie in Abb. 5b gezeigt, zeigten beide Fasern eine hohe Auflösungsrate. Es zeigte sich, dass sich die Modell-Linezolid-Fasern schneller aufzulösen begannen, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Größe, aber die Modell-Vancomycin-Fasern erreichten aufgrund der geringeren Fasermasse, die aufgelöst werden musste, zuerst ihre vollständige Auflösung (7 Minuten). Dennoch erreichten die Linezolidfasern nach 9 Minuten ihre vollständige Auflösung. Basierend auf dieser Beobachtung muss das Pflaster einige Minuten lang auf die Wunde aufgetragen werden, bevor die Ozonabgabe aktiviert wird, um eine vollständige Auflösung der Fasern und Diffusion in die Wundstelle sicherzustellen, bevor Ozon aufgetragen wird.

Auflösungscharakterisierung von Arzneimittel freisetzenden NFs. (a) Auflösungsrate von NF, hergestellt mit teilweise hydrolysiertem und vollständig hydrolysiertem PVA. (b) Zeitliche Auflösung von teilweise hydrolysierten NFs, denen arzneimittelähnliche Substanzen infundiert wurden (Rot für Vancomycin und Blau für Linezolid). (c) Anteil des bis zur kritischen Zeit von 10 Minuten (< 3 % der gesamten Behandlungsdauer) gelösten Materials für NFs in flüssigen und gelförmigen Medien. (d) Vergleich der Zeit, die benötigt wird, um eine kritische Auflösung von NFs mit blauem Farbstoff (Linezolid) in Pufferlösung mit unterschiedlichen pH-Werten zu erreichen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Es ist wichtig, dass sich die für die Anwendung der Antibiotika verwendeten NFs im Vergleich zur gesamten Behandlungsdauer in kurzer Zeit auflösen können, um die Dauer zu maximieren, in der beide Komponenten der Zusatztherapie im Wundbett aktiv sind. Es wurde festgestellt, dass eine Gesamtauflösungszeit von bis zu 10 Minuten mehr als ausreichend sein sollte, um eine ordnungsgemäße Aktivität sowohl des Ozons als auch der bei der Behandlung verwendeten Antibiotika zu ermöglichen. Um dieses Kriterium zu erfüllen, wurden NFs in entionisiertem Wasser (wie zuvor beschrieben) und in Agargel getestet, um eine simulierte halbfeste Wundumgebung nachzuahmen. Abbildung 5c zeigt die Ergebnisse und zeigt, dass die NFs selbst in der simulierten Wundgelumgebung innerhalb des gewünschten Zeitrahmens von 10 Minuten vollständig aufgelöst wurden. Da schließlich der pH-Wert in einem infizierten Wundbett variieren kann, wurde die Auflösung der Modell-Linezolidfasern in Lösungen mit drei verschiedenen pH-Werten charakterisiert. Die Fasern wurden erneut zugeschnitten und Pufferlösungen mit pH-Werten von 6, 7 und 8 ausgesetzt. Abbildung 5d zeigt einen Vergleich der Zeit, die benötigt wird, um bei jedem pH-Wert eine kritische Auflösung (> 80 %) zu erreichen. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass der pH-Wert der Lösung nur einen sehr geringen Einfluss auf die Auflösungszeit hatte.

Vor der Bewertung der Kombinationstherapie wurde eine systematische Untersuchung der Ozonbehandlungsniveaus durchgeführt, um die geeignete Konzentration der Ozontherapie zu ermitteln, um die bakteriziden Eigenschaften zu maximieren und gleichzeitig eine minimale toxische Wirkung auf menschliche Zellen zu haben. Für diesen Test wurden drei verschiedene Ozonerzeugungsraten, 2 mg/h, 4 mg/h und 8 mg/h, zur Behandlung von P. aeruginosa und E. coli, zwei der häufigsten G − ve-Bakterien in Wunden, getestet Infektionen61. Zur optimalen Beobachtung der antimikrobiellen Eigenschaften jeder Generationsrate wurden Bakterienkulturen in PBS suspendiert. Als Testkulturmedium für diese Experimente wurde PBS gewählt, um eine homöostatische Umgebung zu schaffen, in der die Bakterien weder aktiv absterben noch sich vermehren. Dies ermöglichte einen expliziten Vergleich der antimikrobiellen Eigenschaften der Ozonbehandlung bei verschiedenen Anwendungsmengen. Abbildung 6 zeigt, dass bei beiden Stämmen höhere Ozonerzeugungsraten erwartungsgemäß zu einer schnelleren Abtötung führten, während P. aeruginosa insgesamt eine höhere Empfindlichkeit gegenüber der Ozonbehandlung zeigte. P. aeruginosa-Kulturen wurden nach 5, 3 bzw. 2 Stunden für Ozonerzeugungsraten von 2 mg/h, 4 mg/h und 8 mg/h aus den Testvertiefungen entfernt und zeigten eine signifikantere Steigerung der Wirksamkeit, wenn die Erzeugung von 2 auf 2 erhöht wurde auf 4 mg/h als bei einem weiteren Anstieg von 4 auf 8 mg/h. Auch die Ergebnisse zu E. coli stützen diesen Trend. Bei einer Ozonerzeugungsrate von 2 mg/h wurde innerhalb von 8 Stunden keine vollständige Abtötung von E. coli-Kulturen beobachtet, während bei 4 mg/h nach 5 Stunden und bei 8 mg/h nach 3 Stunden eine Abtötung eintrat.

Antimikrobielle Wirksamkeit und Zelllebensfähigkeit bei kontinuierlicher Exposition gegenüber unterschiedlichen Ozonwerten (2–8 mg/h). Antimikrobielle Wirkung gegen (a) P. aeruginosa- und (b) E. coli-Bakterienkulturen in PBS über einen Zeitraum von 8 Stunden. (c) Zelllebensfähigkeit menschlicher Fibroblasten, behandelt mit 6 Stunden Ozon bei 2–8 mg/h bei 37 °C. Die Lebensfähigkeit wurde 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach Behandlungsende gemessen. (d) Lebend-/Tot-Färbung menschlicher Fibroblastenzellen, die 1 Tag und 7 Tage nach der Behandlung unterschiedlich starken Ozontherapien ausgesetzt waren. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Auch die Auswirkung unterschiedlicher Ozonerzeugungsraten menschlicher Fibroblasten wurde untersucht. Abbildung 6c zeigt den Prozentsatz gesunder Zellen nach 6 Stunden Ozonexposition bei jeder Erzeugungsrate 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach der Exposition, was in Abb. 6d abgebildet ist. Es ist ersichtlich, dass höhere Ozonwerte, nämlich 8 mg/h, Stress auf die Zellen auslösen, was zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit um 50 % führt, während sowohl 2 mg/h als auch 4 mg/h keine Anzeichen von Toxizität zeigten. Unter Berücksichtigung sowohl der antimikrobiellen Leistung als auch der Zytotoxizität jeder Erkrankung zeigte sich, dass 4 mg/h in der Lage sind, schnelle und wirksame antimikrobielle Eigenschaften bei minimaler Zytotoxizität bereitzustellen, und wurde daher als geeignete Einstellung für die Ozonerzeugung ausgewählt.

Da die Wundumgebung das Bakterienwachstum begünstigt, erfordert die beschleunigte Replikationsrate eine höhere Ozonkonzentration für ausreichende antimikrobielle Eigenschaften. Dies ist zwar wirksam, kann jedoch zu zytotoxischen Nebenwirkungen für die menschlichen Zellen führen. Um diesen Bedenken entgegenzuwirken, wird eine systematische Studie zur Kombinationswirkung von Antibiotika mit zusätzlicher Ozontherapie vorgestellt, um eine erhöhte antimikrobielle Wirkung ohne schädliche Nebenwirkungen zu erzielen. Um die positiven Auswirkungen der Zusatztherapie zu zeigen, wurde die Ozon- und Antibiotikabehandlung an Stämmen von P. aeruginosa und E. coli, G − ve-Bakterien, die häufig in SSTIs vorkommen, getestet. Für diese Tests wurden zwei Antibiotika ausgewählt, die üblicherweise zur Behandlung von G+ve-Bakterien eingesetzt werden: Vancomycin und Linezolid. Durch die Auswahl von Antibiotika, die normalerweise nur bei G + ve-Bakterien eingesetzt werden, konnten diese Tests den Wirksamkeitsnachweis für Ozon als Zusatztherapie zur Sensibilisierung von G − ve-Bakterien gegen resistente Antibiotika erbringen. Zusätzlich wurde eine Behandlung von Bakterienkulturen in tryptischen Sojabrühen-Wachstumsmedien und bei 37 °C durchgeführt. Diese für das Bakterienwachstum optimalen Bedingungen wurden ausgewählt, um die Wirksamkeit der Zusatzbehandlung in einer Umgebung zu zeigen, die der einer natürlichen Wunde zur Förderung des Bakterienwachstums entspricht oder diese übertrifft. Darüber hinaus ist das Wachstum von Bakterien, die sowohl in einer infizierten Wunde als auch in den hier dargestellten simulierten Bedingungen vorhanden sind, erforderlich, um die volle Wirkung der Antibiotika auf die Bakterien erkennen zu können.

Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse der antibakteriellen Eigenschaften und Biokompatibilitätsergebnisse der Zusatztherapie. Abbildung 7a zeigt, dass die Zusatztherapie mit Linezolid und gasförmigem Ozon einen signifikanten Anstieg der antibakteriellen Aktivität zeigte. Im Vergleich zur anfänglichen bakteriellen KBE/ml-Messung zeigten sowohl die Negativkontrolle (keine Behandlung) als auch die Linezolid- und Vancomycin-Kontrollen (nur Antibiotika) ein signifikantes Bevölkerungswachstum, da sich die gesunden Bakterien in den Medien weiter vermehrten. Dies zeigt, dass die Antibiotika allein das Wachstum der Bakterien überhaupt nicht wie erwartet hemmten. Die Ozonprobe, die 6 Stunden lang 4 mg/h Ozon ausgesetzt war, zeigte eine moderate Bakterienreduktion von 1,52 log10 KBE/ml. In Kombination mit Vancomycin zeigte die Zusatzbehandlung eine signifikante Reduzierung um 2,52 log10 KBE/ml. Darüber hinaus zeigte Ozon in Kombination mit Linezolid eine noch größere Wirksamkeit mit vollständiger Eliminierung aller Bakterien (6,62 log10 KBE/ml). Die statistische Analyse zeigte statistisch signifikante Ergebnisse sowohl für Ozon- als auch für Kombinationstherapien (p < 0,0001). In beiden Fällen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Ozon- und Antibiotikabehandlungen zusammen wirksamer sind als die Summe ihrer Teile.

Antibakterielle Wirksamkeit gegen Bakterienkulturen in TSB-Medien und Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit des Tests zur zusätzlichen Ozon- und Antibiotikatherapie in vitro bei 37 °C. (a) Ergebnisse für die Zusatztherapie mit Ozon + Linezolid und Ozon + Vancomycin bei P. aeruginosa. (b) Antibakterielle Ergebnisse der Ozon + Linezolid- und Ozon + Vancomycin-Zusatztherapie bei E. coli. Ozon wurde 6 Stunden lang mit 4 mg/h appliziert. Linezolid und Vancomycin wurden in einer Lösung von 200 μg/ml angewendet. (c) Lebensfähigkeit menschlicher Fibroblastenzellen, die 6 Stunden lang einer Behandlung mit Ozon, Ozon + Vancomycin und Ozon + Linezolid ausgesetzt waren, gemessen 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach Behandlungsende. (d) Lebend-/Totfärbung menschlicher Fibroblasten 1 Tag und 7 Tage nach Behandlungsende. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Das gleiche Testverfahren wurde auch an E. coli durchgeführt, einem weiteren G-ve-Bakterium, das häufig in Hautwunden vorkommt. Abbildung 7b zeigt die Ergebnisse sowohl für die Vancomycin- als auch für die Linezolid-Zusatztherapie. Wie bei P. aeruginosa beobachtet, zeigten die Negativkontrolle und die Antibiotikakontrollen während der 6-stündigen Behandlung keine Hemmung des Bakterienwachstums. Die Ozontherapie allein zeigte keinen Rückgang der Bakterienpopulation, während die Kombinationstherapie wiederum eine signifikante Steigerung der Wirksamkeit zeigte, wobei die Linezolid-Zusatztherapie die Bakterien vollständig eliminierte (6,02 log10 KBE/ml Reduktion) und die Vancomycin-Zusatztherapie eine 0,57 log10 KBE/ml ermöglichte. ml-Reduktion. Der Leistungsunterschied zwischen Linezolid und Vancomycin lässt sich durch die beiden unterschiedlichen Moleküle und Wirkmechanismen erklären. Es ist bekannt, dass Vancomycin durch Bindung an die Peptidschicht der Zellwand wirkt, was die Vernetzung hemmt und während der Teilung zur Zelllyse führt. Da Vancomycin ein großes Molekül ist (1449,3 Da), ist es im Allgemeinen daran gehindert, auf die Peptidschicht in G − ve-Bakterien zuzugreifen, da bei solchen Stämmen eine zusätzliche äußere Lipidschicht vorhanden ist62,63. Es wird vermutet, dass Ozon es einigen Vancomycin-Molekülen ermöglicht, diese Schutzschicht durch oxidative Zerstörung zu umgehen, aber die Effizienz reicht für eine Wirkung mit voller Wirkung nicht aus. Linezolid hingegen ist ein viel kleineres Molekül (337,3 Da), das die Bakterienvermehrung hemmt, indem es an RNA-Stränge bindet, die für die Proteinproduktion notwendig sind64,65. Aufgrund seiner geringeren Größe kann Linezolid durch die durch das Ozon erzeugten oxidativen Löcher leichter in die Bakterienzelle gelangen. Darüber hinaus kann die Kombination zweier unterschiedlicher Wirkmechanismen von Ozon und Linezolid bei gleichen Anwendungsbedingungen eine höhere Effizienz bei der Abtötung von Bakterien zeigen. Diese Ergebnisse bestätigen die Vorteile der Verwendung von gasförmigem Ozon als Zusatztherapie zur Sensibilisierung von G − ve-Bakterien gegenüber Antibiotika, die normalerweise nur für G + ve-Stämme eingesetzt werden. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da es sich um einen Machbarkeitsnachweis handelt, der zeigt, dass die durch das Ozon verursachten oxidativen Reaktionen es neuen Antibiotikamolekülen ermöglichen, gegen Bakterien zu wirken, die zuvor im Wesentlichen immun gegen ihre Wirkung waren. Durch die Erhöhung der Anzahl wirksamer Antibiotika und die potenzielle Umgehung entwickelter Resistenzen kann dieser Kombinationsansatz Möglichkeiten bieten, Antibiotika, die nicht mehr wirksam waren, wiederzuverwenden.

Um sicherzustellen, dass die Anwendung von Ozon die Wirkung der Antibiotika nicht beeinträchtigt, wurden abschließend zwei Tests durchgeführt. Zunächst wurden von beiden Antibiotikaproben vor und nach 8 Stunden Ozonexposition Fourier-Transformations-Infrarotmessungen (FTIR) durchgeführt, die keine Veränderung der Molekülstruktur zeigten. Zweitens zeigen antibakterielle Tests mit Vancomycin und Linezolid an G + ve-Bakterien vor und nach 8 Stunden Ozonexposition ebenfalls keine Änderung der Wirksamkeit aufgrund einer längeren Ozonexposition bei 4 mg/h. Diese beiden Tests bestätigen weiter, dass das durch das Pflaster abgegebene gasförmige Ozon keine nachteiligen Auswirkungen auf die antibiotischen Verbindungen hatte. Weitere Einzelheiten finden Sie in den unterstützenden Informationen.

Es wurde zuvor gezeigt, dass eine Langzeitexposition (6 Stunden) menschlicher Fibroblastenzellen gegenüber gasförmigem Ozon, das bei 4 mg/h erzeugt wird, keine Anzeichen von Stress oder verminderter Lebensfähigkeit der Zellen zeigte. Hier war es auch wichtig, die Sicherheit der Kombinationstherapie mit topischen Antibiotika als gasförmigem Ozon bei diesen Konzentrationen zu bewerten und zu bestätigen, dass durch die Kombinationstherapie keine zytotoxischen Verbindungen entstehen. Durch die Untersuchung der Biokompatibilität konnten wir zeigen, dass das Behandlungssystem sowohl wirksam als auch sicher in der Anwendung ist. Um dies zu bestätigen, wurden systemische Biokompatibilitätstests an menschlichen Fibroblastenzellen durchgeführt, bei denen die Zellen entweder der Ozontherapie (mit oder ohne Antibiotika) ausgesetzt wurden oder als Kontrolle belassen wurden. In jedem Fall wurden die Zellproben einer testhemmenden Konzentration einer Lösung ausgesetzt, die entweder Linezolid, Vancomycin oder kein Antibiotikum enthielt. Die Tests wurden unter den gleichen Ozonparametern von 6 Stunden und 4 mg/h wie die antibakteriellen Studien durchgeführt. Abbildung 7c zeigt die Ergebnisse eines In-vitro-MTT-Assays und einer Lebend/Tot-Färbung (Abb. 7d), die durchgeführt wurden, um die Lebensfähigkeit von Fibroblastenzellen (normalisiert gegenüber der Kontrollgruppe) zu bewerten, die mit Antibiotika in Kombination mit antibiotikafreisetzenden elektrogesponnenen Nanofasern behandelt wurden . Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der mit Ozon, Ozon + Vancomycin, Ozon + Linezolid behandelten Zellen betrug 98,6 %, 99 % bzw. 98,2 % nach einem Tag und 98,8 %, 98,5 % bzw. 97,2 % nach 7 Tagen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Kombinationsbehandlungsansatz keine nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von Fibroblastenzellen hatte.

In dieser Arbeit präsentieren wir zum ersten Mal ein tragbares Gerät für die integrierte Anwendung einer zusätzlichen Ozon- und Antibiotikatherapie gegen resistente Stämme von G − ve-Bakterien. Das neuartige kombinierte Abgabesystem für Antibiotika und gasförmiges Ozon wird durch die Verwendung schnell auflösender PVA-Nanofasern, die Antibiotika enthalten, erreicht. Die Entwicklung, Struktur und Durchlässigkeit der NF-Matte erwiesen sich als sehr förderlich für die Zusatzbehandlung. Die vom System angewendeten Ozonwerte wurden optimiert, um eine Behandlung mit hoher antibakterieller Wirksamkeit bei minimaler Zytotoxizität für menschliche Zellen zu erreichen. Schließlich wurden umfangreiche Arbeiten durchgeführt, um die Wirksamkeit der Zusatztherapie zwischen Ozon und zwei häufig gegen G+ve-Bakterien wirksamen Antibiotika, Vancomycin und Linezolid, zu validieren. Es wurde gezeigt, dass diese Kombination die Behandlung der gramnegativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und E. coli in vitro deutlich verbessert, ohne Anzeichen einer Zytotoxizität zu zeigen. Dieses System ist vielversprechend als wirksame Therapiemethode für infizierte Hautwunden und kann die Zahl der Behandlungsmöglichkeiten für Ärzte und Patienten deutlich erhöhen, da die Prävalenz antibiotikaresistenter Infektionen weiter zunimmt. Weitere systematische In-vivo-Forschung in diesem Bereich wird die notwendige Validierung liefern, während die Technologie in Richtung klinischer Studien und zur Anwendung am Menschen weiterentwickelt wird. Diese Plattform könnte eine neue Möglichkeit bieten, mit der Ozon-Kombinationstherapie bisherige Antibiotika wieder wirksamer zu machen. Dies ist ein entscheidender Schritt zur Lösung der Krise chronischer Wunden und zur Behandlung resistenter Infektionen.

Der Wundverband und das Pflaster wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt, das in unserer vorherigen Arbeit37 beschrieben wurde. Kurz gesagt wurde eine Mischung aus PDMS (Sylgard 184) im Verhältnis 1:5 w/w in Heptan verdünnt und zum Beschichten des Rayon-Spandex-Gewebes (84,5 mm × 67 mm) verwendet, das zur Herstellung des Verbandes verwendet wird, um hydrophobe Eigenschaften zu induzieren. Nach dem Trocknen wird es mit dem PDMS-Träger verbunden, wobei die interne Dispersionsschicht dazwischen zur Vergrößerung der ozonbeeinflussten Fläche dient. Die Verklebung des Systems erfolgte mit 3 M 300LSE doppelseitigen Klebestreifen. Die biologisch abbaubaren Wirkstofffreisetzungs-NFs wurden aus einer Polyvinylalkohol (PVA) (ausgewählt aufgrund gut dokumentierter Biokompatibilität und hoher Löslichkeit in Wasser) und einer Wasserlösung (10 % w/w PVA) gesponnen. Die Antibiotika wurden mit 1 % w/w sowohl für Vancomycinhydrochlorid (1404-93-9 Chemimpex) als auch für Linezolid (165800-03-3 Chemimpex) zugesetzt. Um das NF-Netz zu erzeugen, wurde der Verband auf die Trommel der Elektrospinnmaschine (Tong Li Tech TL-Pro-BM) geklebt. Die Fasern wurden aus einer Nadel unter Verwendung einer 18-g-Spitze mit einem Potenzial von 20 kV und -2 kV und einer Durchflussrate von 0,65 ml/min bei einem Abstand von Spitze zu Kollektor von 14 cm unter Verwendung einer 10 %igen PVA-in-Wasser-Lösung (P1763 vollständig) gesponnen hydrolysiertes PVA oder 843.869 teilweise hydrolysiertes PVA (MW = 70.000), Sigma-Aldrich). Fasern wurden auf einem Substrat abgelegt, das an einer rotierenden Trommel (10 cm Durchmesser, 30 U/min) befestigt war, um eine Antibiotikakonzentration von 200 µg/cm2 zu erreichen.

Die Bildgebung der Fasern wurde durchgeführt, um Struktur, Größe und Pore des erzeugten Netzes zu identifizieren. Die optische Bildgebung wurde mit einem Steindorff OM durchgeführt. SEM-Bilder wurden mit einem Hitachi S-4800 Field Emission SEM bei 4 kV und 20 mA aufgenommen, nachdem die Proben mit Au-Pd auf 36 nm sputterbeschichtet wurden. Die Bildverarbeitung ermöglichte die Messung der Faser- und Porengröße in aufgenommenen Bildern und wurde mit der ImageJ-Software mit den Mess- und Partikelanalysetools durchgeführt.

Kontaktwinkelmessungen zur Quantifizierung der Probenhydrophobie wurden dreifach mit einem Ramé-Hart Model 290 F1 Advanced Goniometer durchgeführt. Die Messungen des Luftstromdrucks wurden dreifach mit einem Omega DPG 4000-Drucksensor erfasst und der Luftstrom wurde mit einer New Era 1000-Spritzenpumpe erzeugt. Durch jede Probe wurde ein konstanter Fluss angelegt, während gleichzeitig der Druck abgelesen wurde, um den internen Druckaufbau aufgrund des Widerstands gegen den Fluss durch die Probe zu messen.

Um die Auflösung der PVA-NFs zu messen, wurden NFs wie zuvor beschrieben elektrogesponnen auf ein Aluminiumfoliensubstrat, das an der Tong Li-Elektrospinntrommel befestigt war. Um mit sichtbaren Farbstoffen anstelle von Antibiotika beladene NFs für die spektrophotometrische Analyse zu erzeugen, wurden dem PVA Farbstoffe in den mit jedem Arzneimittel verbundenen Wasserlöslichkeitsniveaus zugesetzt (0,1 % Direct Red 80 [Sigma Aldrich 365548) und 0,03 % Methylenblau (Sigma Aldrich M9140)] und wurde geschleudert, um eine Masse von 20 µg/cm2 zu erhalten. Beide Farbstoffe wurden ausgewählt, um die Molekülgröße der Antibiotika nachzuahmen (ergänzende Abbildung 1). Alle anderen Abscheidungseigenschaften wurden beibehalten. Die Proben wurden mit einem PLS6MW-Laserschneider mit einem 40-W-Faserlaser (1,06 μm) zugeschnitten. Um die Auflösungsrate zu charakterisieren, wurden 0,3 cm2 große Proben in eine 96-Well-Platte gegeben und 300 μl entionisiertem Wasser ausgesetzt. Ein Probensatz wurde nach 1 Minute entnommen und jede weitere Probe nach weiteren 2 Minuten. Anschließend wurde die Lösung zur Homogenisierung geschüttelt und 100-μl-Proben in eine weitere Platte mit 96 Vertiefungen pipettiert und die Absorption mit einem BMG ClarioSTAR PLUS-Spektrophotometer gemessen. Ein ähnliches Verfahren wurde für die pH-Varianzexperimente wiederholt, wobei das DI-Wasser durch klare Pufferlösung (Sigma-Aldrich) mit pH-Werten von 6, 7 und 8 ersetzt wurde, und auch für die Untersuchung der Auswirkung des Hydrolysegrades mit P1763 vollständig hydrolysiertes PVA oder 843.869 teilweise hydrolysiertes PVA (MW = 70.000). Jede Probe wurde dreifach gemessen.

Der Gelauflösungstest, der zur Nachahmung der Wundbettbedingungen verwendet wird, wurde unter Verwendung von niedrig schmelzendem Agarosegel, gelöst in Wasser zu 0,5 % (Gew./Gew.), durchgeführt (Sigma-Aldrich). Anschließend wurde die Agarose in 1-ml-Proben in eine Platte mit 12 Vertiefungen pipettiert und aushärten gelassen. 1 cm2 große Kreise aus blauen (Linezolid) NFs auf dem Al-Foliensubstrat wurden mit dem PLS6MW-Laserschneider in Form geschnitten und auf der Geloberfläche platziert. Der erste Probensatz wurde nach 1 Minute entnommen und dann jede weitere Probe nach weiteren 2 Minuten. Gelproben mit gelösten Fasern wurden dann durch Hitzeeinwirkung aufgelöst und gerührt, bevor 100 μl Proben extrahiert und zur optischen Messung mit dem BMG ClarioSTAR in eine 96-Well-Platte pipettiert wurden. Jede Probe wurde dreifach gemessen.

Die klinischen Isolate von P. aeruginosa (25668) und E. coli (25922), zwei häufig in SSTIs vorkommenden G − ve-Pathogenen, wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Alle Medien und Antibiotika wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Bakterienkulturen wurden aus gefrorenem Bestand in einer Lösung von Tryptic Soy Broth (TSB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) wiederbelebt und über Nacht inkubiert. Eine Probe aus dem wiederbelebten Bestand wurde 1:50 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um ein Ausgangsinokulum von etwa 107 KBE/ml zu erreichen. 50 μL Proben wurden in eine 96-Well-Platte pipettiert, sodass an jedem Messpunkt drei neue Wells entnommen werden konnten. Drei solcher Platten wurden vorbereitet und jeweils eine einer Ozontherapie mit 2 mg/h, 4 mg/h und 8 mg/h durch den zuvor beschriebenen gasdurchlässigen Verband ausgesetzt, der aus der hydrophoben Membranschicht, der internen Dispersionsschicht und dem PDMS-Träger besteht . Ozongas wurde kontinuierlich 8 Stunden lang bei Raumtemperatur zugeführt. Jede Stunde wurden 20-μl-Proben aus drei Vertiefungen entnommen und seriell verdünnt, um sie auf TSB-Agarplatten auszuplattieren.

Biokompatibilitätsexperimente wurden an das zuvor von Kasi et al.66 verwendete Verfahren angepasst. Die Zytokompatibilität der Ozonbehandlung wurde mit NIH/3T3-Fibroblastenzellen (erworben von ATCC) durch einen enzymgesteuerten kolorimetrischen Assay, CellTiter 96 Aqueous One (Promega), analysiert. Das Enzym nutzt ATP, um die Enzymfunktion anzutreiben, sodass nur lebende Zellen das Substrat in die im Spektrophotometer nachweisbare Verbindung umwandeln. Die Platten wurden mit NIH/3T3-Zellen in DMEM-Medium mit 10 % FBS kultiviert. Um die Zytokompatibilität zu testen, wird den Zellen am Tag 0 Ozon (2–8 mg/h) über Pads ausgesetzt. In jeder Vertiefung befanden sich 5000 Zellen/ml Suspension. Zur Untersuchung der Zelllebensfähigkeit für jede Konzentration wurden 3 Platten verwendet. In jeder Platte wurden 3 Vertiefungen als Replikat verwendet. Der unterschiedlichen Ozonkonzentration wurde 6 Stunden lang in der Zellkulturkammer (CO2-Kammer, 37 °C) ausgesetzt. Als Kontrolle dienten auch die Zellen ohne Ozonbehandlung. Die DMEM-Suspension wurde jeden Tag aus den Testvertiefungen abgesaugt und mit 200 µL MTT-Reagenz bedeckt. Das Verhältnis von Reagenz zu Medium betrug 20:100 µL, sodass insgesamt 200 µL die Proben abdeckten. Mit NIH/3T3-Zellen verbundene Proben durften das Substrat 1 Stunde lang reduzieren. Dann wurden drei Aliquots von 100 µL auf eine 96-Well-Platte übertragen. Die optische Absorption der Proben wurde bei einer festen Wellenlänge von 490 nm im Spektrophotometer SpectraMax M2 (MolecularDevices, USA) gemessen, das mit einem leeren MTT-Reagenz kalibriert wurde. Es wurde auch eine Live/Dead-Bildgebung durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen bei unterschiedlicher Ozonexposition zu untersuchen. Zur Untersuchung der visuellen Zelllebensfähigkeit wurde der gleiche oben im MTT-Assay erwähnte Aufbau verwendet. Die NIH/3T3-Fibroblastenzellen wurden gezüchtet; Die Zellen wurden unter Verwendung von Calcein-AM und Ethidium homodimer − 1 in unterschiedlichen Zeitintervallen wie Tag 1, 3 und 7 auf Lebend/Tot untersucht. Die NIH/3T3-Zellen wurden wie oben in der MTT-Analyse erwähnt gezüchtet, und drei identische Platten wurden dazu verwendet Für die Studie wurden Kontrollproben (keine Behandlung) verwendet. Die Zellen werden mit den entsprechenden Filtern in der Nikon Ti2 Eclipse abgebildet, die mit einer Kamera unter einem 10-fach optischen Objektiv und der NIS-Elements D-Software ausgestattet ist.

Um die antibakterielle Wirkung von Ozon in Kombination mit Antibiotika zu testen, wurden dieselben ATCC 25668 P. aeruginosa- und ATCC 25922 E. coli-Kulturen in einer Lösung von Tryptic Soy Broth (TSB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) beimpft und über Nacht inkubiert . Eine Probe der reifen Kultur wurde in neuem TSB im Verhältnis 1:500 verdünnt (Ausgangsinokulum etwa 106), um die Nährstoffe bereitzustellen, die für ein kontinuierliches Bakterienwachstum während des Tests erforderlich sind, um die Wundumgebung besser nachzuahmen. Das neue Kulturmedium wurde dann in dreifacher Ausfertigung im Verhältnis 1:10 mit einer Linezolid- oder Vancomycin-Lösung in entionisiertem Wasser bei 2000 μg/ml in die Testvertiefungen pipettiert. Die endgültige Lösung in jeder Vertiefung hatte ein Volumen von 50 μl und eine Antibiotikakonzentration von 200 μg/ml.

Die Bakterienproben wurden einer Kombinationsbehandlung von 4 mg/h Ozon mit Vancomycin bei 200 μg/ml und Linezolid bei 200 μg/ml unterzogen. Diese Antibiotikakonzentration wurde ausgewählt, um eine hohe (10-fache) Konzentration bereitzustellen, um eine ausreichende Antibiotikastärke für die Behandlung normal resistenter Bakterienstämme zu ermöglichen41,67,68,69,70. Während des Tests wurden die Testproben bei 37 °C gehalten, um sicherzustellen, dass ein ordnungsgemäßes Bakterienwachstum möglich war. Nach 2, 4 und 6 Stunden wurden 20 μl-Proben aus den dafür vorgesehenen Vertiefungen entnommen und auf TSB-Agarplatten ausplattiert. Die Bakterienkolonien wurden nach Inkubation über Nacht bei 37 °C gezählt. Proben aus experimentellen Zusatztherapien wurden mit einer Behandlung nur mit Ozon und Kontrollkulturen, die Antibiotika ohne Ozon ausgesetzt waren, verglichen.

Experimente zur Biokompatibilität der Zusatztherapie folgten dem oben für die Ozontherapie beschriebenen Verfahren66. Kurz gesagt, die Ozon-Zusatzbehandlung wurde mit von ATCC erworbenen NIH/3T3-Fibroblastenzellen unter Verwendung desselben kolorimetrischen Tests analysiert. Kulturplatten mit 5000 Zellen/ml Zellen wurden am Tag 0 mit 4 mg/h Ozon und 200 μg/ml Vancomycin oder 200 μg/ml Linezolid getestet und mit Zellen ohne Behandlung verglichen. Die Kombinationsbehandlung erfolgte 6 Stunden lang in der Zellkulturkammer bei 37 °C. Der MTT-Assay wurde in einer Menge von 20:100 µL jeder Probe zugesetzt und man ließ das Substrat 1 Stunde lang reduzieren. Drei 100-µL-Proben wurden zur optischen Absorptionsmessung bei 490 nm mit dem Spektrophotometer auf eine 96-Well-Platte übertragen. Zusätzlich wurden die Proben nach 1, 3 und 7 Tagen einer Live/Dead-Bildgebung ausgesetzt und mit Kontrollergebnissen verglichen. Färbebilder wurden mit einer 10-fachen optischen Linse aufgenommen.

Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der Proben (α = 0,05) für antibakterielle Tests wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test verwendet. Anschließend wurde der Dunnet-Test für Mehrfachvergleiche durchgeführt, um statistische Unterschiede zwischen verschiedenen Bedingungen und Zeitpunkten zu überprüfen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern des Birck Nanotechnology Center an der Purdue University für ihre Unterstützung während des gesamten Projekts sowie dem Purdue Mechanical Engineering Department und dem Purdue Materials Engineering Department.

Fakultät für Maschinenbau, Purdue University, West Lafayette, USA

Alexander Roth

Birck Nanotechnology Center, West Lafayette, USA

Alexander Roth, Sina Nejati, Akshay Krishnakumar, Vidhya Selvamani, Sotoudeh Sedaghat und Rahim Rahimi

Abteilung für Pharmakotechnik und Molekularpharmazeutik, Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, USA

Murali Kannan Maruthamuthu & Juliane Nguyen

Abteilung für Werkstofftechnik, Purdue University, West Lafayette, USA

Sina Nejati, Vidhya Selvamani, Sotoudeh Sedaghat und Rahim Rahimi

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, Purdue University, West Lafayette, USA

Akshay Krishnakumar

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften und Pathobiologie, Virginia Tech, Blacksburg, USA

Mohamed N. Seleem

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AR führte die Herstellung, Charakterisierung und antibakteriellen Tests durch. SN und AK halfen bei antibakteriellen Tests. SS führte eine REM-Bildgebung durch. VS und MKM haben zum Biokompatibilitätsverfahren beigetragen. JN und MS gaben mikrobiologische Anweisungen und Feedback. RR sorgte für die technische Aufsicht und Anleitung.

Korrespondenz mit Rahim Rahimi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Roth, A., Maruthamuthu, MK, Nejati, S. et al. Tragbares Ozon- und Antibiotika-Zusatztherapiesystem zur Behandlung von gramnegativen dermalen bakteriellen Infektionen. Sci Rep 12, 13927 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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Eingegangen: 25. März 2022

Angenommen: 26. Juli 2022

Veröffentlicht: 17. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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