Die Etablierung von COPD-Organoiden zur Untersuchung des Wirts

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7635 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist durch eine Einschränkung des Luftstroms und infektiöse Exazerbationen gekennzeichnet. Es fehlen jedoch In-vitro-Modellsysteme zur Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion auf individueller Ebene. Hier beschreiben wir die Etablierung von nasopharyngealen und bronchialen Organoiden gesunder Personen und COPD, die Krankheiten auf individueller Ebene rekapitulieren. Im Gegensatz zu gesunden Organoiden wurden bei COPD-Organoiden eine Becherzellhyperplasie und eine verringerte Ziliarschlagfrequenz beobachtet, charakteristische Merkmale der Krankheit. Einzelzell-Transkriptomik deckte Hinweise auf veränderte Zelldifferenzierungsverläufe in COPD-Organoiden auf. Eine SARS-CoV-2-Infektion von COPD-Organoiden zeigte eine produktivere Replikation in den Bronchien, dem Hauptinfektionsort bei schwerem COVID-19. Die virale und bakterielle Exposition von Organoiden löste bei COPD-Organoiden stärkere proinflammatorische Reaktionen aus. Zusammenfassend präsentieren wir ein Organoidmodell, das die physiologische Lungenmikroumgebung in vivo auf individueller Ebene nachbildet und für die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion und neu auftretender Infektionskrankheiten geeignet ist.

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine chronisch entzündliche Atemwegserkrankung mit hoher globaler Morbidität und Mortalität1. Sie ist gekennzeichnet durch die Entwicklung einer fortschreitenden irreversiblen Atemwegsbeschränkung, heterogener Endophänotypen und unterschiedlicher Krankheitsverläufe zwischen einzelnen Patienten2,3. Die Patienten leiden unter anhaltenden und fortschreitenden Atemwegsbeschwerden, beeinträchtigter Lungenfunktion, strukturellen Lungenanomalien und Exazerbationen4. Patienten mit COPD zeigen auch eine höhere Prävalenz der Entwicklung von Komorbiditäten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, die mit schlechteren klinischen Ergebnissen und einem höheren Mortalitätsrisiko einhergehen5. Da die Komplexität und Heterogenität der COPD zwischen einzelnen Patienten mittlerweile allgemein anerkannt ist, bleibt die zellbasierte Forschung aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Modellen, die die Krankheit auf individueller Ebene rekapitulieren, eine große Herausforderung6,7. Kleintiermodelle, darunter Mäuse, Meerschweinchen und Kaninchen, wurden alle zur Untersuchung von COPD verwendet. Sie können jedoch die Genetik und Epigenetik menschlicher Krankheiten nicht rekapitulieren, erfordern die Induktion von COPD und ahmen, sobald sie etabliert sind, nicht unbedingt das gesamte klinische Spektrum der beobachteten Endophänotypen nach bei einzelnen Patienten8,9. Daher wird die Etablierung von Zellmodellen der nächsten Generation, die solche Einschränkungen überwinden und individuelle Variationen berücksichtigen, von entscheidender Bedeutung sein, um die molekularen Mechanismen, die Infektionen und Behandlungsreaktionen auf individueller Ebene bei COPD zugrunde liegen, besser zu verstehen und die Anwendung einer praxisorientierten Präzisionsmedizin zu ermöglichen.

Um solche personalisierten Studien zu ermöglichen, ist die Entwicklung leicht zugänglicher In-vitro-Modelle, die die Mikroumgebung der Atemwege bei COPD auf individueller Ebene reproduzieren, von größter Bedeutung. Bis heute mangelt es an geeigneten experimentellen Modellen zur Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion bei COPD. Im letzten Jahrzehnt gab es große Fortschritte bei der Erzeugung von aus Stammzellen gewonnenen Organoiden, die mehrere Zelltypen in einer dreidimensionalen Architektur enthalten10. Organoide stellen ein Laborinstrument dar, um gewebespezifische Funktionsmerkmale ihres jeweiligen Organs nachzubilden und die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion zu erleichtern. Organoidmodelle der menschlichen Lunge, die die Epithelorganisation ihrer jeweiligen anatomischen Region reproduzieren, wurden erfolgreich aus Nasen-11,12, Bronchial-13 und Alveolargeweben14,15 unter Verwendung adulter oder pluripotenter Stammzellen als Ausgangsmaterialien16,17,18 erzeugt. Lungenorganoide wurden zur Untersuchung von Lungenkrebs13,19 und Mukoviszidose13 sowie zur Bewertung von Infektionen einschließlich des Respiratory Syncytial Virus (RSV)13, Enterovirus20, Cryptosporidium21, Influenza22,23 und kürzlich des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verwendet. 24,25,26. Klinische und epidemiologische Daten deuten darauf hin, dass COPD mit schweren COVID-19-Verläufen verbunden ist, einschließlich eines höheren Risikos für Krankenhausaufenthalte und Tod, obwohl treibende Mechanismen fehlen27,28,29,30,31,32,33,34.

Neben Virusinfektionen sind bakterielle Infektionen für einen erheblichen Anteil der Exazerbationen bei COPD verantwortlich, wobei die vorherrschenden Spezies Streptococcus pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa sind35.

Hier zeigen wir die Etablierung und Charakterisierung von COPD-Lungenorganoiden und wenden diese auf die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion, einschließlich SARS-CoV-2 und Pseudomonas aeruginosa, an. Unsere COPD-Organoidmodelle rekapitulieren die physiologische Lungenmikroumgebung in vivo und führen zu erhöhten Entzündungsreaktionen auf virale und bakterielle Infektionen.

Primäre menschliche nasopharyngeale und bronchiale Organoide (NPOs bzw. BOs) wurden mit zuvor beschriebenen Methoden mit Modifikationen etabliert (Abb. 1a)13. Ein gut differenziertes Atemwegsorganoid entwickelt ein einzelnes oder gelegentlich mehrere Lumen, die von Keulen-, Becher- und Flimmerzellen ausgekleidet sind. Basalzellen befinden sich außen und bewegliche Zilien, die die Schleimwirbelung erleichtern, wurden nach innen sichtbar gemacht (Abb. 1b, c, ergänzende Abb. 1 und ergänzendes Video 1). Immunfluoreszenzfärbung von nicht erkrankten Organoiden zeigte zelluläre Marker für Tumorprotein 63 (TP63) + Basalzellen, Sekretoglobin Familie 1 A Mitglied 1 (SCGB1A1) + Keulenzellen, acetyliertes α-Tubulin (Ac-Tubulin) + Flimmerzellen und Mucin 5AC (MUC5AC) + Becherzellen sowohl in NPOs als auch in BOs (Abb. 1b, c, ergänzende Abb. 1). Es wurden deutliche Unterschiede zwischen NPOs und BOs beobachtet, insbesondere waren BOs stärker bewimpert, mit ausgedehnten Ac-Tubulin+-Zilienstrukturen und einer höheren FOXJ1-Genexpression (Abb. 1b, c, ergänzende Abb. 1). Quantitative PCR (qPCR) bestätigte, dass BOs im Vergleich zu NPOs signifikant mehr TP63, SCGB1A1 und FOXJ1 exprimieren, obwohl eine ähnliche MUC5AC-Expression zwischen NPOs und BOs festgestellt wurde (Abb. 1d – g).

a Schematische Darstellung der Isolierung primärer menschlicher Nasopharyngeal- und Bronchialepithelzellen und der Erzeugung menschlicher Organoide. b Immunfluoreszenzfärbung menschlicher nasopharyngealer Organoide (NPOs) (obere Atemwege) für TP63 (Basalzellen: grün), SCGB1A1 (Keulenzellen: lila), acetyliertes α-Tubulin (Ac-Tubulin) (Zilienzellen: grün) und MUC5AC ( Becherzellen: lila). Kerne und F-Aktin werden mit DAPI (blau) bzw. Phalloidin (rot/weiß) gegengefärbt. Maßstabsbalken = 20 μm. C. Immunfluoreszenzfärbung menschlicher Bronchialorganoide (BOs) (untere Atemwege). Maßstabsbalken = 20 μm. Die Daten in BC sind repräsentativ für mindestens 5 unabhängige Experimente. d–g qRT-PCR-Analyse der aus NPOs und BOs extrahierten Gesamt-RNA für (D) TP63 (Basalzellen), (E) SCGB1A1 (Keulenzellen), (F) FOXJ1 (Zilienzellen) und (G) MUC5AC (Becherzellen). ). Dargestellt sind n = 7 und n = 3 biologisch unabhängige Experimente für NPOs bzw. BOs. Die Daten werden als Mediane ± Interquartilbereich dargestellt und der Mann-Whitney-U-Test wird durchgeführt. *P < 0,05 [TP63 = 0,0333; SCGB1A1 = 0,0238; FOXJ1 = 0,0238]. HNPEC: Menschliche nasopharyngeale Epithelzellen; BALF: Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit; HBEC: Menschliche Bronchialepithelzellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

NPOs und BOs, die von COPD-Patienten stammen (GOLD-Stadium B, C und D), enthalten alle Zelltypen, die in nicht erkrankten Organoiden beobachtet werden (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 1). Charakteristisch für COPD-Organoide war eine größere Häufigkeit von Becherzellen, einschließlich einer signifikant erhöhten MUC5AC-Genexpression bei COPD im Vergleich zu nicht erkrankten NPOs (Abb. 2a – c). Bei COPD-BOs waren verminderte Keulen- und Flimmerzellpopulationen erkennbar, die für den Krankheitszustand charakteristisch sind (ergänzende Abbildungen 1, 2b, c). Wenn COPD-Organoide nach Exazerbationen bei ihren Spendern geschichtet wurden, war eine zunehmende Exazerbationshäufigkeit signifikant mit einer höheren MUC5AC-Genexpression in ihrer jeweiligen Organoidkultur verbunden (Abb. 2d). Ein enger Zusammenhang wird mit der Lungenfunktion beobachtet, wobei diejenigen mit der schlechtesten Lungenfunktion (<30 % FEV1 % vorhergesagt) die höchste MUC5AC-Genexpression aufweisen, was weiter durch eine signifikante umgekehrte Beziehung zwischen MUC5AC-Genexpression und FEV1 % vorhergesagt (R = −) veranschaulicht wird 0,5890; p = 0,0008; Abb. 2e, f). Wichtig ist, dass sich diese zelluläre Assoziation mit klinischen COPD-Korrelaten nicht auf andere im Organoidmodell vorhandene Zelltypen erstreckt (ergänzende Abbildung 2). COPD weist eine beeinträchtigte mukoziliäre Clearance auf, die zu einer Infektion führt, und das Vorliegen einer solchen Dysfunktion wurde bei den abgeleiteten nicht erkrankten und COPD-BOs durch mikrooptische Kohärenztomographie (µOCT)-Bildgebung beurteilt. BOs zeigten eine klare Visualisierung der funktionellen Zilien, und die Zilienschlagfrequenz (CBF) war bei COPD-BOs im Vergleich zu nicht erkrankten BOs signifikant niedriger (Abb. 2g, h und Zusatzvideo 2).

a Immunfluoreszenzfärbung menschlicher nasopharyngealer Organoide (NPOs) und b menschlicher Bronchialorganoide (BOs) von nicht erkrankten Personen (links) und Patienten mit COPD (rechts) für MUC5AC (lila). Das obere Feld zeigt das Äußere des Organoids, während das untere Feld das Lumen des Organoids zeigt. Maßstabsbalken = 20 μm. Die Daten in ab sind repräsentativ für mindestens 5 unabhängige Experimente. c qRT-PCR-Analyse der Gesamt-RNA, die aus NPOs und BOs von nicht erkrankten Personen (ND) und COPD-Patienten extrahiert wurde, auf MUC5AC. ND und COPD im GOLD-Stadium B, C und D werden durch schwarze, blaue, gelbe bzw. grüne Symbole gekennzeichnet. n = 7; n = 10; n = 3 und n = 8 biologisch unabhängige Experimente für NPO-ND; NPO-COPD; BO-ND und BO-COPD werden dargestellt. Die Daten werden als Mediane ± Interquartilbereich dargestellt und der Mann-Whitney-U-Test wurde durchgeführt. ***P < 0,001. [NPO-ND vs. NPO-COPD = 0,0004] d MUC5AC-Genexpression in NPOs und BOs, die von ND und COPD abgeleitet sind, letztere stratifiziert nach Exazerbationshäufigkeit als Nicht-Exazerbator (NE); Exazerbator (E) und Frequent-Exacerbator (FE). Dargestellt sind n = 28 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mediane ± Interquartilbereich dargestellt und der Mann-Whitney-U-Test wird durchgeführt. *P < 0,05; ****P < 0,0001. [ND vs. NE = 0,0117; ND vs. E < 0,0001; ND vs. FE < 0,0001]. e Lungenfunktion als forciertes Exspirationsvolumen in der 1. Sekunde in Prozent vorhergesagt (FEV1 % vorhergesagt). Dargestellt sind n = 28 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mediane ± Interquartilbereich dargestellt und der Mann-Whitney-U-Test wurde durchgeführt. ***P < 0,001; **** P < 0,0001. [ND vs. 50–79 %=0,0003; ND vs. 30–49 % <0,0001; ND vs <30 % <0,0001]. f Streudiagramm, das die MUC5AC-Genexpression in COPD-Organoiden gemäß dem vorhergesagten FEV1 % korreliert. Dargestellt sind n = 28 biologisch unabhängige Proben. Es wurde eine Korrelationskoeffizientenanalyse (nicht parametrisch) nach Spearman durchgeführt. P = 0,0008. g Repräsentative Bilder, die mithilfe der mikrooptischen Kohärenztomographie (μOCT) von ND- und COPD-Bronchialorganoiden bei 0 und 14 s (s) aufgenommen wurden. Maßstabsbalken = 50 μm. Die Daten in g sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. h Quantifizierung der Messung der Zilienschlagfrequenz (CBF) in Hertz (Hz) von Bronchialorganoiden, die aus ND (n = 3) und COPD (n = 3) stammen. Pro Spender werden 6 bis 10 Organoide in bis zu 10 Regionen mit Ziliaraktivität pro Bildsequenz ausgewertet, um den CBF zu bestimmen. Die Daten werden als Mediane ± Interquartilbereich dargestellt und der Mann-Whitney-U-Test wird durchgeführt. ***P < 0,001 [P = 0,0008]. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Einzelzelltranskriptome zeigen, dass unsere In-vitro-Lungenorganoide die wichtigsten Zellpopulationen, die in den nativen In-vivo-Atemwegen vorkommen, originalgetreu nachbilden, einschließlich zyklischer Basalzellen, Basalzellen, Keulenzellen, Becherzellen und Flimmerepithelzellen (Abb. 3a, ergänzende Abbildung 3a). ) sowohl in NPOs als auch in BOs (Ergänzende Abbildung 3c, d). Obwohl es sich um eine kleine Probengröße handelt, stimmt dieses Ergebnis mit unserer Immunfluoreszenz- und qPCR-Analyse überein, wie dargestellt (Abb. 1, 2). Zellidentitäten wurden auf der Grundlage der von Garcia et al. abgeleiteten Atemwegs- und Lungenzellsignatur-Gensätze annotiert. (2019) und Travaglini et al. (2020) unter Verwendung von Markergenen für jeden jeweiligen Zellcluster36,37 (Supplementary Data 1). Wir haben die Zellidentität außerdem mithilfe spezifischer Markergene bestätigt, beispielsweise MKI67 für zyklische Basalzellen, TP63 und KRT5 für Basalzellen, SCGB1A1 für Clubzellen, MUC5AC für Becherzellen und FOXJ1 für Flimmerepithelzellen (ergänzende Abbildung 3b). Es wurde ein einzelner kleiner Cluster entdeckt, der etwa 1,4 % der gesamten Zellen ausmachte und nur eine KRT5-Expression zeigte. Daher haben wir diese konservativ als „Epithelzellen“ klassifiziert. Im Vergleich zu nicht erkrankten Organoiden zeigten COPD-Organoide weniger zyklische Basalzellen (5,4 % gegenüber 16,0 %) und Flimmerepithelzellen (3,2 % gegenüber 5,2 %), aber mehr Basalzellen (45,7 % gegenüber 35,6 %) und Becherzellen (15,9 % gegenüber 11,5). %). Die Clubzellpopulationen waren vergleichbar (29,4 % gegenüber 29,3 %) (Abb. 3b). Die höhere Häufigkeit von Becherzellen und der geringere Anteil von Flimmerzellen weisen auf die für COPD charakteristische Becherzellhyperplasie und Zilienanomalien hin.

a UMAP-Diagramme der scRNA-seq-Transkriptomdaten heben die wichtigsten Zelltypen hervor, die in Lungenorganoiden von nicht erkrankten (ND) (links; n = 8614 Zellen) (Zusammenfassung einer NPO-ND-Linie und einer BO-ND-Linie) und COPD nachgewiesen wurden (rechts; n = 11.263 Zellen) (Zusammenlegung einer NPO-COPD-Linie und einer BO-COPD-Linie). b Gestapelte Balkendiagramme der relativen Häufigkeit der neun Hauptzelltypen in ND- und COPD-Organoiden. c Pseudozeitanalyse von ND- (oben) und COPD-Organoiden (unten), die den variablen Verlauf der zyklischen Entwicklung von Basalzellen in Flimmer- und Becherzelllinien veranschaulicht. d Heatmap, die veränderte Expressionsmuster, basierend auf zelltypspezifischen Markern, in ND- und COPD-Organoiden veranschaulicht. Die Zellen sind nach ihrem jeweiligen Krankheitszustand geordnet: ND oder COPD, Zelltyp, Pseudozeit und durch die bereitgestellten Farbschlüssel nach Expressionsniveau dargestellt. e Balkendiagramme, die die am besten angereicherten kanonischen Pfade der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) veranschaulichen, die von unterschiedlich exprimierten Genen von COPD bis zu ND-Organoiden für Basal-, Keulen- und Becherzellen abgeleitet sind. Der vorhergesagte Aktivitäts-Z-Score von IPA ist farblich gekennzeichnet (rot: Aktivierung; blau: Hemmung; grau: kein Aktivitätsmuster verfügbar).

Als nächstes bewerteten wir öffentlich verfügbare Massen-RNAseq-Datensätze, die aus den kleinen Atemwegen bei COPD stammen (GSE162154), und verglichen das Expressionsprofil von DEGs mit denen, die in der Pseudobulk-Analyse unserer scRNAseq-Daten beobachtet wurden. Durch hierarchisches Clustering werden unterschiedliche Cluster von gesunden und COPD-Proben sichtbar. In COPD-Organoiden nachgewiesene wichtige Funktionswege, darunter mitochondriale Dysfunktion, endoplasmatischer Retikulumstress, Zilienreorganisation, Umbau der extrazellulären Matrix und proinflammatorische Zytokinsignale, waren sowohl in der Pseudobulk-Analyse als auch in öffentlichen Datensätzen gemeinsam (ergänzende Abbildung 4b, c). Basalzellen aus COPD-Organoiden weisen ein äußerst konsistentes Funktionsmuster auf, das bei anderen Zelltypen nicht beobachtet wird, und weisen einen veränderten Entwicklungsverlauf bei der Umwandlung von Basalzellen in Flimmer- und Becherzelllinien auf (Abb. 3c). Eine hohe Häufigkeit von Basalzellen in den Atemwegen und in Organoiden kann dazu führen, dass andere Zelltypen in der Massen-RNAseq-Analyse unterrepräsentiert sind. Dies spiegelt sich in den funktionellen Ähnlichkeiten wider, die zwischen Basalzelltranskriptomen von Lungenorganoiden und den öffentlich zugänglichen Massen-RNAseq-COPD-Datensätzen beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 4c).

Die Erfassung von Transkriptomen mit Einzelzellauflösung in COPD-Organoiden ermöglicht die Beurteilung funktioneller Veränderungen, die mit kleineren Zelltypen verbunden sind und durch Massen-RNAseq nicht erkennbar sind. Es wurden jeweils zwei Subpopulationen von Basal-, Club- und Becherzellen mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit zwischen nicht erkrankten und COPD-Organoiden identifiziert, wobei COPD-Organoide durch die folgenden Gruppen überrepräsentiert sind: Basalzellen 2 (35,3 % gegenüber 4,7 %), Club Zellen 2 (15,6 % gegenüber 1,2 %) und Becherzellen 2 (10,4 % gegenüber 0,7 %), von denen keine in nicht erkrankten Organoiden beobachtet wurde (Abb. 3b – d). Die Gruppen Basalzellen 2 und Clubzellen 2 stellen auch den vorherrschenden Zwischenzelltyp dar, der im veränderten Entwicklungsverlauf von Basalzellen in COPD-Organoiden beobachtet wird (Abb. 3b – d). COPD-Organoide zeigen im Vergleich zu nicht erkrankten Organoiden einen beeinträchtigten Übergang von einem Zelltyp zum anderen (Abb. 3c, d). Dies wird durch einen deutlichen Verlust der Markergenexpression in Basalzellen 2, Clubzellen 2 und Becherzellen 2 belegt, die alle in COPD-Organoiden überrepräsentiert sind, und durch ihre nachweisbare Expression von Markergenen aus anderen Zelltypen (Abb. 3b–d, Ergänzende Abbildungen 3d, 4a). Zusammengenommen deutet dies auf eine punktuelle Differenzierung von Zellen aus COPD-Organoiden hin, die wahrscheinlich auf die COPD-Pathogenese zurückzuführen ist.

Um die Funktionsunterschiede zwischen nicht erkrankten und COPD-Organoiden weiter zu untersuchen, haben wir funktionelle Unterschiede zwischen den Basal-, Keulen- und Becherzellen jedes Organoidmodells untersucht. Alle drei Zelltypen in COPD-Organoiden zeigen eine Störung ähnlicher kanonischer Signalwege (Abb. 3e). In Basal- und Clubzellen wurden der EIF2-Signalweg und die oxidative Phosphorylierung deutlich aktiviert, während die Sirtuin-Signalübertragung leicht unterdrückt wurde. In Becherzellen wurden umgekehrte Trends beobachtet. Unabhängig davon erfassten Gene-Set-Anreicherungsanalysen (GSEA) ähnliche Störungen, deckten jedoch zusätzlich die Aktivierung von Immunzellen in allen drei Atemwegszelltypen auf (ergänzende Abbildung 4d).

Unsere abgeleiteten menschlichen Lungenorganoide eignen sich für die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion. Um solche Infektionsstudien zu erleichtern und den direkten Zugang des infizierenden Mikroorganismus zur luminalen Zellpopulation zu ermöglichen, wurden NPOs und BOs neu ausgerichtet, um eine apikale Polarität zu erreichen (Abb. 4a, b). Organoide mit nach außen gerichteten Zilien wurden innerhalb von 72 Stunden in Suspension differenziert und Basalzellen im Inneren des Organoids ohne sichtbares Lumen positioniert. Funktionell kompetente Zilien, die jetzt nach außen gerichtet sind, induzieren die Selbstrotation der gesamten Organoidstruktur (Zusatzvideo 3).

a Schematische Darstellung des methodischen Arbeitsablaufs für die SARS-CoV-2-Infektion von NPOs und BOs. b Bildliche Darstellung von „basal-out“- und „apical-out“-Atemwegsorganoiden (oben) und Immunfluoreszenzfärbung von NPOs in „basal-out“- und „apical-out“-Polarität für TP63 (Basalzellen: rot) und Ac-Tubulin (Flimmerzellen: grün) (unten). Maßstabsbalken = 20 μm. c Immunfluoreszenzfärbung von NPOs und BOs, die von nicht erkrankten Personen stammen, für ACE2 (grün). Maßstabsbalken = 20 μm. Die Daten in BC sind repräsentativ für mindestens 5 unabhängige Experimente. d–e Virusreplikationskinetik aus Kulturüberständen, die von SARS-CoV-2-infizierten (d) NPOs und (e) BOs 1, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion (hpi) mittels TCID50-Assay geerntet wurden. n = 4 und n = 3 biologisch unabhängige Experimente für NPOs bzw. BOs. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und es wird eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 [NPO: 48 hpi: L-WU vs. O-614D = 0,0005; G-614G vs. O-614D = 0,0002; 72 PSI: L-WU vs. O-614D = 0,0170; G-614G vs. O-614D = 0,0006; 96 PSI: L-WU vs. G-614G = 0,0041; G-614G vs. O-614D = 0,0011; BO: 24 hpi: L-WU vs. O-614D = 0,0070; G-614G vs. O-614D = 0,0065; 48 PSi: G-614G vs. O-614D = 0,0048]. f–g qRT-PCR der gesamten RNA, extrahiert aus SARS-CoV-2-infizierten (f) NPOs und (g) BOs, bei 48 bzw. 72 hpi für Interleukin-6 (IL-6), Interferon-β (IFN-β) , CXC-Motiv-Chemokinligand 10 (CXCL10) und Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF-α). Es werden n = 3 biologisch unabhängige Experimente dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und es wird eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt. *P < 0,05; **P < 0,01. [NPO: IFN-β: MK vs. G-614G = 0,0399; G-614G vs. O-614D = 0,0484; CXCL10: 48 PSI: MK vs. L-WU = 0,0156; 72hpi: MK vs. L-WU = 0,0259; MK vs. G-614G = 0,0018; G-614G vs. O-614D = 0,0017; L-WU vs. O-614D = 0,0236; ΤΝF-α: 48hpi: MK vs. G-614G = 0,0254; L-WU vs. G-614G = 0,0069; G-614G vs. O-614D = 0,0098; 72hpi: MK vs. G-614G = 0,0374;L-WU vs. G-614G = 0,0062] [BO: IL-6: MK vs. G-614G = 0,0054; L-WU vs. G-614G = 0,0282; G-614G vs. O-614D = 0,0066; IFN-β: MK vs. G-614G = 0,0055; L-WU vs. G-614G = 0,0185; G-614G vs. O-614D = 0,0092]L-WU: Clade L-Wuhan-Stamm; G-614G: Clade-G-Stamm und O-614D: Clade-O-Stamm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

NPOs und BOs von nicht erkrankten Personen und COPD exprimieren ACE2, TMPRSS2, Furin und Neuropilin-1, die alle eine Schlüsselrolle bei der SARS-CoV-2-Infektion spielen (ergänzende Abbildung 5a – d). Bemerkenswert ist, dass die Genexpression von ACE2, TMPRSS2 und Neuropilin-1 in den unteren Atemwegen bei nicht erkrankten Spendern signifikant höher war, ohne dass es bei COPD Unterschiede zwischen den oberen und unteren Atemwegen gab (ergänzende Abbildung 5a – d). ACE2 wurde in NPOs und BOs nachgewiesen, unabhängig von ihrer Polarität und unabhängig vom Zelltyp oder der Zellverteilung (Abb. 4c). Unsere Einzelzellanalyse zeigt, dass ACE2 in mehreren Zelltypen exprimiert wird und TMPRSS2 in den meisten Zelltypen, insbesondere in Flimmerepithelzellen, allgegenwärtig war, während Furin weitgehend mit Neuropilin-1 kolokalisierte (ergänzende Abbildung 6). Interessanterweise zeigten COPD-NPOs im Vergleich zu nicht erkrankten Personen eine höhere ACE2- und TMPRSS2-Expression, während bei COPD-BOs ein kontrastierendes Muster beobachtet wurde (Ergänzende Abbildungen 5a, b, 6).

Für alle vier SARS-CoV-2-Faktoren werden signifikante Zusammenhänge zwischen zunehmender COPD-Exazerbationshäufigkeit und höherer Genexpression festgestellt (ergänzende Abbildung 5e – h). Wenn die Lungenfunktion berücksichtigt wird, wird eine signifikant höhere Expression von TMPRSS2, Furin und Neuropilin-1 bei COPD mit der schlechtesten Lungenfunktion beobachtet (<30 % FEV1 % vorhergesagt) und nur Furin zeigte eine signifikante umgekehrte Beziehung zum FEV1 % vorhergesagt (R = − 0,4880; p = 0,0072) (Ergänzende Abbildung 5i – p).

Spontane Mutationen im SARS-CoV-2-Genom, die während der gesamten Pandemie kontinuierlich erworben werden, verändern die virale Fitness. Wir haben daher drei Patientenisolate ausgewählt, um ihre unterschiedliche Pathogenese zu bewerten: einen angestammten Wuhan-Stamm in Clade L (L-WU, GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_407987), einen Clade-O-Stamm (O-614D, GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_574486) und ein Clade-G-Stamm (G-614G, GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_574489). Aminosäureveränderungen wurden im Spike-Protein D614G, ORF1ab und ein Stoppcodon in NS6 zwischen G-614G und L-WU identifiziert, während in O-614D weitere Mutationen in ORF1ab, S, NS7a und N nachgewiesen wurden (Ergänzung). Tabelle 1). Eine SARS-CoV-2-Infektion löste bei NPOs über den Infektionszeitraum von 96 Stunden keine zytopathischen Wirkungen aus (ergänzende Abbildung 7). Die durch qPCR 48 und 72 Stunden nach der Infektion (hpi) ermittelte virale Infektiosität zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Isolaten oder zwischen den oberen und unteren Atemwegen (ergänzende Abbildung 8a – c). L-WU und G-614G replizierten sich produktiv in NPOs und BOs, während O-614D trotz nachweislicher produktiver Replikation in Vero-E6-Zellen nicht replizierte (Abb. 4d, e, ergänzende Abb. 8d – f und 10). In NPOs, die repräsentativ für die oberen Atemwege und ein wichtiger Ort für die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2 sind, replizierte G-614G mit 96 hpi deutlich höhere Titer als L-WU und erweiterte sich auf 168 hpi (Abb. 4d, ergänzende Abb. 8g). ). Darüber hinaus lösen G-614G-infizierte Organoide verstärkte proinflammatorische Immunantworten bei 72 hpi aus, die durch eine verstärkte Genexpression von Interferon-β (IFN-β), CXC-Motiv-Chemokinligand 10 (CXCL10) und Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF-α) gekennzeichnet sind NPOs und Interleukin-6 (IL-6) bzw. IFN-β in BOs (Abb. 4f, g). Eine G-614G-Infektion von NPOs und BOs erhöht CXCL10 bei 72 hpi signifikant (Ergänzende Abbildungen 8h und 9).

Klinische und epidemiologische Daten deuten darauf hin, dass COPD ein unabhängiger Risikofaktor für eine schwere COVID-1934-Erkrankung ist. Als nächstes untersuchten wir daher die Infektiosität, die Virusreplikation sowie die proinflammatorischen und antiviralen Reaktionen in Atemwegsorganoiden, um zelluläre Korrelate für diese klinischen Befunde aufzuklären. Die Untersuchungen basierten auf einer Infektion mit den Stämmen L-WU und G-614G, nicht jedoch mit O-614D, da letzterer sich in den nicht erkrankten Modellen nicht replizierte und keine Entzündungsreaktionen auslöste. In COPD-Organoiden aus den oberen und unteren Atemwegen wurden bei 48 und 72 hpi hohe Werte an SARS-CoV-2-Infektiosität festgestellt, die mit denen im nicht erkrankten Zustand vergleichbar sind (ergänzende Abbildung 11). Interessanterweise zeigt die Virusreplikationskinetik, dass sich L-WU in NPOs weniger effizient replizierte, jedoch wurde eine verstärkte Replikation in den BOs beobachtet, die von COPD-Patienten stammten (Abb. 5a, b). Für die G-614G-Variante wurden keine Unterschiede zwischen COPD und nicht erkrankten NPOs beobachtet, obwohl auch bei ersteren eine deutlich verstärkte Replikation in den unteren Atemwegen (d. h. BOs) erkennbar war (Abb. 5c, d). Bemerkenswert ist, dass in den qPCR- und TCID50-Experimenten Zelllysate (zum Nachweis der Nukleokapsid (NS)-Genexpression) und Kulturüberstände (zum Nachweis lebender infektiöser Viren) verwendet wurden, was die beobachteten Unterschiede zwischen der gemessenen Viruslast und den Virustitern erklärt. Zusammengenommen deutet dies jedoch auf eine insgesamt verbesserte Replikationskompetenz des G-614G und vor allem auf ein deutlich erhöhtes und robustes Potenzial für die Virusreplikation in den COPD-Bronchien hin, dem vorherrschenden Ort für die Entwicklung schwerer COVID-1934-Erkrankungen (Abb. 5c, d ). Die qPCR-Bewertung von IL-6, IFN-β und CXCL10 ergab keine Unterschiede zwischen den NPOs und BOs nach einer L-WU-Infektion mit und ohne COPD. Die Infektion mit G-614G zeigte jedoch eine signifikante Verringerung von IL-6 und IFN-β in den unteren COPD-Atemwegen mit einem Trend zur Hemmung von CXCL10 im Vergleich zu nicht erkrankten Personen (Abb. 5e–h).

a–d Virusreplikationskinetik von L-WU-infizierten und G-614G-infizierten NPOs und BOs bei 1, 24, 48, 72 und 96 hpi mittels TCID50-Assay. Dargestellt sind n = 3 biologisch unabhängige Experimente für NPO- und BO-Infektionen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und es wird ein ungepaarter t-Test durchgeführt. *P < 0,05; ***P < 0,001. [NPO L-WU: 24 hpi=0,0494; 72 PSi=0,0004; BO L-WU: 24 hpi=0,0110; 96 PSi=0,0152; BO G-614G: 24 PSi=0,0294; 96 PSi=0,0457]. e–h qRT-PCR-Analyse der Gesamt-RNA, die aus L-WU-infizierten und G-614G-infizierten NPOs und BOs extrahiert wurde, die von nicht erkrankten Personen bzw. COPD-Patienten stammen, bei 72 hpi für IL-6, IFN-β und CXCL10. Es werden n = 3 biologisch unabhängige Experimente dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und ein ungepaarter t-Test wird durchgeführt. *P < 0,05. [Feige. 5h: IL-6 = 0,0237; IFN-β = ​​0,0248] Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der klinische Verlauf der COPD wird durch Episoden klinischer Verschlechterung, sogenannte Exazerbationen, unterbrochen. Bakterielle Infektionen machen einen Teil solcher Exazerbationen aus, und hier haben wir die entzündlichen Folgen von Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae anhand unserer „apikalen“ NPOs von COPD-Patienten untersucht (Abb. 6 und ergänzende Abb. 11). Nicht erkrankte und COPD-NPOs waren vergleichsweise anfällig für Infektionen durch beide Bakterien, und COPD-NPOs lösten eine stärkere proinflammatorische Reaktion auf bakterielle Infektionen auf RNA- und Proteinebene aus, was den Wert unseres COPD-Organoidmodells bei der Beurteilung der Wirtsreaktion auf Infektionen zeigt (Abb. 6b– d und ergänzende Abb. 11). Die transkriptomische Massenanalyse von P. aeruginosa-infizierten COPD-NPOs zeigt im Vergleich zu nicht erkrankten NPOs im nicht infizierten Zustand eine deutlich eingeschränkte Ziliarbewegung und erhöhte sekretorische und extrazelluläre Matrix-Remodellierungsaktivitäten. Wie erwartet löste eine P. aeruginosa-Infektion nicht erkrankter NPOs eine akute Entzündung mit erhöhter Zytokinproduktion und -signalisierung aus (Abb. 6e, f). Bemerkenswerterweise waren die Entzündungs- und Stressreaktionen bei infizierten COPD-NPOs deutlich verstärkt.

a Schematische Darstellung der Methode zur bakteriellen Infektion von NPOs. b qRT-PCR-Analyse der Gesamt-RNA, die aus mit P. aeruginosa infizierten NPOs extrahiert wurde, die von nicht erkrankten Personen und COPD-Patienten stammen, bei 6 hpi für das P. aeruginosa 16 S-Gen. Für ND und COPD wurden jeweils n = 4 und n = 6 biologisch unabhängige Experimente durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. c qRT-PCR-Analyse von P. aeruginosa-infizierten NPOs bei 6 hpi auf C–C-Motiv-Chemokin-Ligand 2 (CCL2), CCL5, CXC-Motiv-Chemokin-Ligand 10 (CXCL10), Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF-α), Interleukin -1β (IL-1β), IL-6 und IL-8. n = 4 für ND und n = 6 für COPD. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und ein ungepaarter t-Test wird durchgeführt. *P < 0,05 [CCL2 = 0,0188; CXCL10 = 0,0239; IL-6 = 0,0470]. d CCL2, CCL4, CXCL10, TNF-β, Interferon-γ (IFN-γ), IL-6, IL-8, IL-9, wachstumsbedingtes Onkogen-α (GRO-α) und Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor ( G-CSF)-Freisetzung bei P. aeruginosa-Infektion in NPOs bei 6 hpi durch Multiplex-Luminex-Assay. n = 5 für ND und n = 6 für COPD. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und ein ungepaarter t-Test wird durchgeführt. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001. [CCL2: COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0039; ND-PAO1 vs. COPD-PAO1 = 0,0062, CCL4: ND-MK vs. ND-PAO1 = 0,0190; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0040; CXCL10: ND-PAO1 = 0,0014; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0217; TNF-β: ND-MK vs. ND-PAO1 = 0,0333; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0096; IFN-γ: ND-MK vs. ND-PAO = 0,0114; ND-PAO1 vs. COPD-PAO1 = 0,0002; IL-6: ND-PAO1 vs. COPD-PAO1 = 0,0238; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0055; IL-8: COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0099; IL-9: COPD-MK vs. COPD-PAO1 < 0,0001; GRO-α: ND-MK vs. ND-PAO1 = 0,0062; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0018; G-CSF: ND-MK vs. ND-PAO1 = 0,0004; COPD-MK vs. COPD-PAO1 = 0,0005; ND = PAO1 vs. COPD-PAO1 = 0,0067]. e Hauptkomponentenanalyse (PCA) von ND- und COPD-NPO-Transkriptomen, die 6 Stunden lang scheinbehandelt oder mit Pseudomonas aeruginosa infiziert wurden (n = 3 pro Gruppe). f Heatmap der unterschiedlich exprimierten Gene (2561 Gene) zwischen mit P. aeruginosa infizierten und nicht infizierten NPOs von ND bzw. COPD. Basierend auf dem Expressionsprofil wurden fünf Hauptgencluster identifiziert und biologische Funktionen mit Anmerkungen versehen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Hier demonstrieren wir die Etablierung und Charakterisierung von COPD-Organoiden, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden, um die Wirt-Pathogen-Interaktion zu untersuchen. COPD-Organoide sind mehrzellige dreidimensionale Sphäroidstrukturen, die wesentliche zelluläre Eigenschaften von COPD aufweisen. COPD-Organoide zeigen eine Becherzellhyperplasie und eine Verringerung der Ziliarschlagfrequenz, die mit der Schwere der Grunderkrankung ihrer jeweiligen Spender zusammenhängt und repräsentativ für die erwartete Krankheitspathologie ist. Die Einzelzellanalyse von COPD-Organoiden ergab Entwicklungs- und Funktionsanomalien, die für den Krankheitszustand repräsentativ sind. Eine SARS-CoV-2-Infektion von COPD-Organoiden zeigt im Vergleich zu gesunden Personen eine produktivere Replikation in den Bronchien, was eine potenzielle Grundlage für die klinischen Beobachtungen schlechterer COVID-19-Ergebnisse bei COPD darstellt.

Der Umbau der Atemwege als Reaktion auf chronische, wiederkehrende Atemwegsverletzungen und -entzündungen ist ein wichtiges pathologisches Merkmal chronischer Atemwegserkrankungen, einschließlich COPD38,39,40. Darüber hinaus sind die COPD-Atemwege durch eine übermäßige Schleimsekretion und eine hohe Anzahl an Becherzellen gekennzeichnet, was zu einer Obstruktion der Atemwege, einer beeinträchtigten mukoziliären Clearance und Exazerbationen führt41,42,43,44. COPD-Organoide rekapitulieren diesen Phänotyp der Becherzellhyperplasie und weisen im Vergleich zu gesunden Personen eine höhere MUC5AC-Genexpression und eine verringerte Ziliarschlagfrequenz auf. Interessanterweise ist die MUC5AC-Genexpression in den Organoiden signifikant mit der zugrunde liegenden Lungenfunktion, der Schwere der Erkrankung und der Exazerbationshäufigkeit eines COPD-Spenders verbunden, und es war ein signifikanter umgekehrter Zusammenhang zwischen der MUC5AC-Genexpression und der Lungenfunktion erkennbar. Diese negative Korrelation steht im Einklang mit einer kürzlich an der COPD-SPIROMICS-Kohorte durchgeführten multizentrischen Studie, die erhöhte MUC5AC-Sputumkonzentrationen bei COPD in Verbindung mit einer schlechteren Lungenfunktion (FEV1 % vorhergesagt) zeigte45. MUC5AC wurde daher als potenzieller Biomarker zur Prognose von COPD vorgeschlagen.

Einzelzell-Transkriptome von COPD-Organoiden zeigen ohne Exposition gegenüber Zigarettenrauch, Entzündungsreizen, proteolytischen Enzymen oder genetischer Veränderung eine hohe Konsistenz mit bestehenden In-vitro- und In-vivo-COPD-Modellen auf phänotypischer, transkriptomischer und funktioneller Ebene46, 47, wenn auch in einer kleinen Stichprobengröße. Diese Analysen offenbaren auch die COPD-Becherzellhyperplasie und veranschaulichen eine punktuelle Zelldifferenzierung bei COPD aufgrund der inhärent abnormalen Zellentwicklung, die ihre Pathogenese charakterisiert. Unsere Pseudozeitanalyse steht im Einklang mit bestehenden Studien, die Defekte in der Gewebeentwicklung, -regeneration und epithelialen Differenzierung nachweisen, einschließlich NOTCH-, Wnt/β-Catenin- und Hedgehog-Signalwegen, die in den COPD-Atemwegen beobachtet werden48,49,50. Mit COPD verbundene biologische Wege, einschließlich mitochondrialer Dysfunktion und Sirtuin-Signalisierung, wurden durch unsere Einzelzellcharakterisierung von COPD-Organoiden aufgedeckt, was den erheblichen Vorteil bietet, kleinere Zellpopulationen zu bewerten, die sich nicht in der Massen-RNAseq widerspiegeln51,52,53. Störungen der mitochondrialen Struktur und Funktion im Lungenepithel beeinflussen Schlüsselprozesse, die von der Zelldifferenzierung, dem Zelltod und dem Zellumbau bis hin zu physischen Barrierefunktionen und der angeborenen Immunität reichen und alle mit der COPD-Pathogenese durch Zigarettenrauchexposition in Zusammenhang stehen54. Eine fehlregulierte mitochondriale Biogenese zusammen mit einer erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) kann zu einem irreversiblen Zellwachstumsstopp oder einer Seneszenz führen, insbesondere wenn sie mit einem Ungleichgewicht zwischen der Oxidations- und Antioxidationskapazität einhergeht, wie es bei COPD beobachtet wird55,56. In Übereinstimmung mit unseren Erkenntnissen ist dies am deutlichsten bei Keulenzellen, Zellen, die im Vergleich zu anderen Epithelzelltypen der Atemwege sehr empfindlich auf oxidative Schäden reagieren57. Darüber hinaus ist Sirtuin 1 (SIRT1) an der Entwicklung und dem Fortschreiten von COPD sowie an der Anfälligkeit für Virusinfektionen beteiligt58,59. In COPD-Lungen werden verringerte SIRT1-Spiegel beobachtet, die mit einer verstärkten Entzündung durch erhöhte Acetylierung von nuklearem RelA/p65 und IL-8-Freisetzung einhergehen59,60. Konsistent ist eine erhöhte Aktivierung von Genen, die mit der Immunantwort verbunden sind, in Basal-, Keulen- und Becherzellen von COPD-Organoiden nachweisbar. Interessanterweise wurden bei COPD-BOs unterschiedliche Zellprofile identifiziert, bei anderen Organoiden jedoch nicht, bei denen „Basalzellen 2“, „Keulenzellen 2“ und „Becherzellen 2“ überrepräsentiert waren. Es wird vermutet, dass das Nasenepithel bei der Erkennung von COPD-assoziierten Genen als Stellvertreter für die Bronchialregion fungiert.61,62 Wir zeigen jedoch, dass unsere aus den oberen und unteren Atemwegen abgeleiteten Organoidmodelle ähnliche COPD-assoziierte Genexpressionsprofile aufweisen unterschiedliche Zellprofile.

Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Personen mit COPD einem höheren Risiko für schweres COVID-19 ausgesetzt sind, einschließlich Krankenhausaufenthalt, Einweisung auf die Intensivstation, Notwendigkeit einer mechanischen Beatmung und Mortalität27,28,63,64,65,66. In dieser Studie zeigen unsere Organoidmodelle, unabhängig vom klinischen Hintergrund, die Expression der wichtigsten SARS-CoV-2-Eintrittsfaktoren und ihrer zugehörigen endogenen Proteasen, einschließlich ACE2, TMPRSS2, Furin und Neuropilin-167,68,69,70,71 ,72. Die ACE2- und TMPRSS2-Expression war in COPD-Organoiden (NPOs) signifikant erhöht, was mit bestehenden Berichten über die Atemwege von Rauchern und COPD-Patienten übereinstimmt73,74,75,76. Anhand von drei phylogenetisch unterschiedlichen SARS-CoV-2-Kladen, die im Jahr 2020 identifiziert wurden, nämlich Klade L, Klade O und Klade G, veranschaulichen wir, dass das G-Klade-Isolat, das eine D614G-Spike-Mutation enthält, zu höheren Virustitern repliziert und robustere proinflammatorische Reaktionen zeigte77,78, sogar zu längeren Zeitpunkten, im Vergleich zu Clade-L- und O-Stämmen, denen eine D614G-Mutation fehlt. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten an tierischen79,80,81,82 und menschlichen Atemwegsmodellen81,83. Entscheidend ist, dass wir zeigen, dass COPD-Organoide anfälliger für eine SARS-CoV-2-Infektion waren, was nach einer Infektion mit G-614G zu einer stärkeren Replikation und Hemmung der IFN-β-Expression, insbesondere im Bronchialbereich, führte. Diese höhere Replikationskompetenz, gepaart mit einer beeinträchtigten antiviralen Immunantwort nach einer G-614G-Infektion, liefert potenzielle mechanistische Erkenntnisse, um teilweise die schlechteren klinischen Ergebnisse zu erklären, die bei COPD-Patienten mit COVID-19 beobachtet werden. Interessanterweise wurde eine effizientere Virusreplikation nur bei BOs von COPD-Patienten nachgewiesen, während bei NPOs im Vergleich zu nicht erkrankten Gegenstücken ein gegensätzlicher Effekt beobachtet wurde. Dieses interessante Ergebnis kann möglicherweise durch die Überrepräsentation der Zellpopulationen von „Basalzellen 2“, „Clubzellen 2“ und „Becherzellen 2“ in COPD-BOs in Verbindung mit der Hemmung von IFN-β verursacht werden. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass Bronchialepithelzellen von COPD-Patienten aufgrund ihrer Anreicherung für die Co-Rezeptor-Expression, Protease-Ungleichgewichten und stärkeren Entzündungsreaktionen anfälliger für eine SARS-CoV-2-Infektion sind84.

Viren sind nach wie vor ein Hauptauslöser für COPD-Exazerbationen85, und eine mangelnde antivirale Immunität bei COPD geht mit einem höheren Risiko für virusbedingte Exazerbationen ein86,87. Es wird eine verringerte IFN-Expression in COPD-Bronchien nach einer Rhinovirus- und/oder Influenza-Infektion beobachtet, während resezierte Lungen von stabiler COPD eine konstitutive Beeinträchtigung von IFN-β, IRF-7 und anderen Interferon-stimulierten Genen (ISGs) aufweisen88,89,90,91 . Häufige COPD-Exazerbatoren, die am deutlichsten bei Patienten mit schwerer Erkrankung auftreten, zeigen einen weiteren Abbau von Typ-I- und III-Interferonen und anderen ISGs im Sputum, selbst während der klinischen Stabilität91,92,93. Wichtig ist, dass diese Arbeit diese Beobachtungen weiter untermauert, indem sie zeigt, dass eine Beeinträchtigung der Interferon-Reaktion nach einer SARS-CoV-2-Infektion ähnlich relevant sein kann.

Bakterien spielen ebenfalls eine wichtige Rolle als Erreger bei COPD-Exazerbationen, wobei Streptococcus pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa zwei der am häufigsten isolierten Bakterienarten darstellen94,95,96. Bakterien werden aus dem COPD-Sputum bei bis zu 50 % der Personen mit mittelschwerer bis schwerer Erkrankung während der Stabilitätsphase isoliert, bei der Exazerbation sind es zwei Drittel der Personen.97,98 Entzündliche Folgen des Vorhandenseins von Bakterien in den COPD-Atemwegen, einschließlich solcher, die mit akuten Exazerbationen einhergehen, sind mit einer schlechteren Lungenfunktion und einem längeren Krankenhausaufenthalt verbunden99,100. COPD-Organoide (NPOs), insbesondere solche, die aus häufigen Exazerbatoren stammen, zeigen trotz vergleichbarer Infektionszulässigkeit verstärkte Entzündungsreaktionen sowohl auf S. pneumoniae als auch auf P. aeruginosa, was zu schlechteren klinischen Ergebnissen bei dieser Patientengruppe beiträgt. Die Verwendung von COPD-Organoiden ermöglicht möglicherweise Einblicke in die Entzündungsreaktion auf potenziell pathogene Organismen auf individueller Ebene und kann bei der Anwendung präziser Ansätze zur Bewertung entzündungshemmender oder antimikrobieller Therapien bei COPD nützlich sein.

Obwohl wir zum ersten Mal COPD-Organoide etablieren und charakterisieren, weist unsere Studie einige Einschränkungen auf. Nasopharyngeale und bronchiale Proben zur Verwendung als Ausgangsmaterial für die Erstellung von Organoidmodellen wurden von verschiedenen einzelnen Spendern und nicht von paarweisen Proben einer Einzelperson entnommen. Menschliche Proben, die zur Erzeugung nicht erkrankter (gesunder) Organoide verwendet wurden, stammten im Vergleich zu COPD-Proben von relativ jüngeren Spendern. Unsere vorgestellte scRNA-Analyse basierte auf einer einzelnen Probe der jeweiligen Gruppe und daher sind weitere Experimente erforderlich, um diese Ergebnisse zu validieren. Während unsere COPD-Organoide physiologisch relevant und repräsentativ für das menschliche Atemwegsepithel sind, mangelt es ihnen an Komplexität wie dem Immun- und Gefäßsystem, was eine ständige Herausforderung auf diesem Gebiet darstellt. Obwohl es von Interesse gewesen wäre, scRNA-Daten von SARS-CoV-2-infizierten Organoiden zu erhalten, wurden diese Experimente aus Sicherheits- und Logistikgründen ausgeschlossen.

Zusammenfassend etablieren und charakterisieren wir COPD-Organoide, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, die strukturell und funktionell den zugrunde liegenden Krankheitszustand darstellen. Solche Modelle ermöglichen die Beurteilung der Reaktion auf eine Infektion und/oder eine medikamentöse Behandlung auf individueller Ebene und können eine nützliche Ergänzung zukünftiger Strategien zur Pandemievorsorge darstellen, wenn sie für ein therapeutisches Screening mit hohem Durchsatz und eine krankheitsbasierte Beurteilung sich entwickelnder Krankheitserreger geeignet sind.

Für die Kultivierung und Charakterisierung von NPOs und BOs wurden 28 Personen rekrutiert, darunter nicht-COPD-freiwillige (gesunde) Freiwillige (n = 10) und Personen mit COPD (n = 18). Als Ausgangsmaterial für die Experimente wurden geflockte Nasopharynxabstriche (FNPS) und/oder Bronchialproben gewonnen, die wie unten beschrieben durch Lungenresektion und/oder faseroptische Bronchoskopie entnommen wurden.

Es wurden Probanden mit normaler Spirometrie und keiner Vorgeschichte von COPD oder einer anderen Atemwegserkrankung rekrutiert. Alle Teilnehmer waren lebenslange Nichtraucher (mit Ausnahme eines einzigen Ex-Rauchers) und alle Teilnehmer nahmen keine Langzeitmedikamente ein. Die demografischen Daten der Teilnehmer sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Patienten im Alter von ca. 45 Jahren mit stabiler COPD, die zur routinemäßigen Nachsorge respiratorische Ambulanzen tertiärer Überweisungszentren aufsuchten, wurden in drei Krankenhäusern in zwei Ländern wie folgt rekrutiert: Singapore General Hospital (Singapur), St. Vincents Hospital (Sydney, Australien) und John Hunter Hospital (Newcastle, Australien). COPD wurde gemäß den Kriterien der Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)1,101 definiert. Patienten mit Asthma in der Vorgeschichte (definiert durch variable Symptome und Einschränkung des exspiratorischen Luftstroms gemäß den Richtlinien der Global Initiative for Asthma; www.ginasthma.org) und Patienten, die langfristig orale Steroide oder andere Immunsuppressiva erhielten, wurden ausgeschlossen. Eine stabile COPD wurde als das Fehlen einer Exazerbation vier Wochen vor Studienrekrutierung definiert. Nicht-Exazerbatoren (NE) wurden durch das Fehlen einer dokumentierten Exazerbation im Jahr vor Studienrekrutierung definiert, während COPD-Exazerbatoren (E) und häufige Exazerbatoren (FE) als Personen mit weniger als bzw. mehr als zwei Exazerbationen im Jahr definiert wurden Rekrutierung vor dem Studium. Eine COPD-Exazerbation wurde als plötzliche Verschlechterung der Atemwegssymptome (Husten, Auswurf, Kurzatmigkeit und/oder Keuchen) definiert, die eine zusätzliche Therapie (Steroide und/oder Antibiotika) erforderte, wie vom primären Atemwegsarzt des Patienten festgelegt1. Für häufige COPD-Exazerbatoren wurde eine Vorgeschichte von wiederkehrenden Exazerbationen trotz einer COPD-Therapie gemäß den GOLD-Richtlinien dokumentiert1.101. Alle rekrutierten Patienten erhielten eine angemessene COPD-Therapie (einschließlich Beratung zur Raucherentwöhnung, Beurteilung des Inhalators, COPD-Aktionspläne, Inhalatoren als langwirksame β-Agonisten, langwirksame Muskarinantagonisten, inhalative Kortikosteroide und/oder kurzwirksame Bronchodilatatoren zusätzlich zur Impfung). angemessen) basierend auf den GOLD-Richtlinien1.101. Alle Patienten wurden einer vollständigen Spirometrie (zur Bestimmung des forcierten Exspirationsvolumens in der 1. Sekunde des vorhergesagten Prozentsatzes (FEV1 % vorhergesagt); FEV1-erzwungene Vitalkapazität; FVC und FEV1/FVC-Verhältnis) gemäß den technischen Standards unterzogen, die durch ATS/ERS-Kriterien definiert sind, gefolgt von nasopharyngeale und/oder bronchiale Probenahme wie unten beschrieben102. Die vollständigen klinischen Daten und demografischen Daten der Studienteilnehmer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Diese Studie wurde von den Institutional Review Boards (IRBs) aller teilnehmenden Krankenhäuser und Institutionen genehmigt und von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Referenznummern für ethische Zulassungen an jedem Standort lauteten wie folgt: CIRB 2020/2338 (Singapur), IRB-2020-05-004 (Nanyang Technological University, Singapur), X02-0137 (The Sydney South West Area Health Service, Australien) und H-163-1205 (The Hunter New England LHD Ethics Committee, Australien). Zur Isolierung der in dieser Studie verwendeten Viren wurden Patientenproben zur Kultivierung gemäß den Richtlinien von PROTECT (2012/00917) gesammelt, wie zuvor beschrieben103, einer multizentrischen prospektiven Studie zur Erkennung neuer Krankheitserreger und zur Charakterisierung neu auftretender Infektionen, die von der National Healthcare Group genehmigt wurde ( NHG) als Teil der Pandemievorbereitung für nationale Krankheitsausbrüche in Singapur. Die im Duke-NUS Medical School Animal Biological Safety Level 3 (ABSL-3)-Labor durchgeführten Arbeiten wurden vom Duke-NUS ABSL3 Biosafety Committee, der National University of Singapore und dem Ministry of Health Singapore (BSL3/2007-03/) genehmigt. DA).

Die Probenahme aus dem Nasopharynx wurde gemäß festgelegten Protokollen von geschultem Personal unter Verwendung von Flocked Nasopharyngeal Swabs (FNPSs) mit dem BBL Universal Viral Transport Standard Kit durchgeführt. Kurz gesagt wurde ein FNPS bis zu einer geeigneten Tiefe in das Nasenloch eingeführt und vor der Entfernung mehrmals gedreht104. Die Proben wurden sofort auf Eis zur Verarbeitung ins Labor gebracht. HNPECs wurden durch mindestens 20-maliges Spülen mit Transportmedium aus den Abstrichtupfern freigesetzt. Die Zellen wurden dann auf mit menschlichem Kollagen IV vorbeschichteten 6-Well-Platten ausplattiert und in B/D-Expansionsmedium (Ergänzungstabelle 3), ergänzt mit 5 μM N-[N-(3,5-Difluorphenacetyl)-L-alanyl], kultiviert. -S-Phenylglycin-t-butylester (DAPT), um als Monoschichten zu wachsen. Das Medium wurde alle 48 Stunden erneuert, bis die Konfluenz erreicht war.

Bei Patienten, die sich einer Lungenresektion, einer Transplantation und/oder einer faseroptischen Bronchoskopie unterzogen, wurden Bronchialproben entsprechend den klinischen Indikationen und gemäß den zuvor beschriebenen Standardrichtlinien entnommen105,106. Bei der Thorakotomie gewonnenes Lungengewebe wurde präpariert und die Atemwege isoliert. Anschließend wurde das Epithel durch Makrodissektion von der Stromaschicht entfernt. In Proben, die durch Bronchoskopie gewonnen wurden, wurden HBECs mithilfe einer einzelnen, ummantelten Nylon-Zytologiebürste ermittelt, die unter direkter Sicht aufgetragen wurde. Von den Bronchien der zweiten bis dritten Generation wurden etwa 4–8 Bürsten entnommen und die Zellen mit DMEM aus den Bürsten gewaschen. Die Zellen wurden dann in Gewebekulturflaschen in Bronchialepithel-Wachstumsmedium (BEGM) mit Wachstumszusätzen ausplattiert und das Medium alle 48 Stunden aufgefrischt, bis die Konfluenz erreicht war.

Nachdem HNPECs und HBECs als Monoschichten Konfluenz erreicht hatten, wurden 2 × 105 Zellen in die apikale Kammer eines 24-Well-Transwells ausgesät, das mit 30 µg/ml PureCol vorbeschichtet war. Der Transwell, der die HNPECs oder HBECs enthielt, wurde zunächst in der submersen Phase kultiviert und sobald die Zellschicht vollständig intakt war, wurde das Medium in der apikalen Kammer entfernt und die Zellen anschließend bei einem ALI kultiviert. Das Medium wurde zweimal pro Woche aufgefrischt und die Zellen wurden 18 Tage lang unter Verwendung von ALI-Differenzierungsmedium (ALI-Diff) (Ergänzungstabelle 4) differenziert und anschließend in Atemwegsorganoide differenziert.

18 Tage lang differenzierte ALI-HNPECs oder ALI-HBECs wurden mit TrypLE aus Transwells abgelöst, in Matrigel resuspendiert und in Airway Organoid (AO)-Medium (Ergänzungstabelle 5) kultiviert, ergänzt mit 25 % R-Spondin-1-konditioniertem Medium, 25 ng/ ml FGF7 und 100 ng/ml FGF10 zur Expansion. Die Zellen expandierten und bildeten im Matrigel kugelförmige Strukturen. Am 5. Tag der Expansion wurden die Sphäroide für weitere 4–6 Wochen zur Differenzierung am ALI in die apikale Kammer eines 12-Well-Einsatzes geleitet. Das Medium wurde zweimal wöchentlich mit AO-Medium mit 5 ng/ml FGF7 und 20 ng/ml FGF10 für 4–6 Wochen aufgefrischt, bis die Organoide gut differenziert waren.

Über Methoden zur Erzeugung von apikal nach außen gerichteten Organoiden wurde bereits von anderen berichtet107,108. Kurz gesagt, NPOs und BOs wurden aus 12-Well-Einsätzen gesammelt und zweimal mit fortgeschrittenem (ad) DMEM/F12 mit 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (P/S) gewaschen. Gewaschene NPOs und BOs wurden mit 5 mM EDTA in PBS 1 Stunde lang bei 4 °C unter Rotation inkubiert, um das verbleibende Matrigel zu solubilisieren. NPOs und BOs wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 200 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde in Medium, das mit 5 ng/ml FGF7 und 20 ng/ml FGF10 ergänzt war, resuspendiert und in Suspension unter Verwendung von 24-Well-Gewebekulturplatten mit extrem geringer Befestigung kultiviert. Suspendierte NPOs und BOs wurden vor den Infektionsstudien 3 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.

In dieser Studie wurden drei SARS-CoV-2-Stämme verwendet, darunter (1) ein Wuhan-Vorfahrenstamm aus Klade L, hCoV-19/Singapore/2/2020 (L-WU) (GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_407987); (2) ein Mitte 2020 isolierter Stamm aus Klade O, hCoV-19/Singapore/1003/2020 (O-614D) (GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_574486) und (3) eine D614G-Variante aus Klade G, hCoV-19/ Singapore/1005/2020 (G-614G) (GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_574489). Der Sequenzvergleich der drei Stämme ist in der Ergänzungstabelle 1 dargestellt. Das Virus wurde in Vero-E6-Zellen vermehrt, die mit DMEM, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % P/S, bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert wurden. Zellkulturüberstände wurden geerntet, zentrifugiert und aliquotiert, sobald ein zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet wurde. Die Virustiter wurden durch begrenzte Verdünnung unter Verwendung der Karber-Methode109 bestimmt.

Vero-E6-Zellen wurden infiziert, um die infektiöse Dosis der Gewebekultur (TCID50/ml) zu bestimmen. Für Titrationstests wurden Vero-E6-Zellen in 96-Well-Platten verwendet. Die Proben wurden seriell in DMEM verdünnt, ergänzt mit 5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin. Die Zellen wurden vierfach mit 100 µL verdünnter Probe infiziert. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen mit CPE aufgezeichnet und der zellfreie Virustiter (TCID50/ml) für jede Probe durch begrenzte Verdünnung unter Verwendung der Karber-Methode bestimmt109.

Vero-E6-Zellen wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät und mit SARS-CoV-2 bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 infiziert, um die Virusreplikationskinetik der drei Stämme zu bestimmen. Die Überstände wurden bei 24, 48, 72 und 96 hpi geerntet und die Virustiter bestimmt.

Apikale NPOs und BOs wurden vor der Infektion einmal mit adDMEM/F12 mit 1 % P/S gewaschen und in 1 ml AO-Medium resuspendiert. 50 µl Organoid wurden entnommen und mit TrypLE Express zur Zellzählung dissoziiert und zur Bestimmung der Gesamtzellzahl und des Virusvolumens für MOI = 0,1 verwendet. Apikale NPOs und BOs wurden 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit SARS-CoV-2 in Suspension auf Ultra-Low-Attachment-Platten infiziert. Nach einstündiger Inkubation wurden infizierte NPOs und BOs dreimal mit adDMEM/F12 und 1 % P/S gewaschen. Die Organoide wurden erneut in 75 % Matrigel eingebettet und mit 30 µl pro Organoidtröpfchen auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Nach dem Erstarren des Matrigels wurden 500 µl AO-Medium in jede entsprechende Vertiefung gegeben. Anschließend wurden Zellkulturüberstände bei 1, 24, 48, 72 und 96 hpi für den TCID50-Assay und den Luminex-Assay geerntet. Zelllysate wurden in Puffer RLT mit β-Mercaptoethanol bei 48 und 72 hpi für quantitative Polymerasekettenreaktionsanalysen (qPCR) gesammelt, wie unten beschrieben.

Der Pseudomonas aeruginosa-Stamm PAO1110 wurde in tryptischer Sojabrühe (TSB) unter Schütteln bei 37 °C über Nacht kultiviert. Der Streptococcus pneumoniae-Stamm INS-E611 (Serotyp 6B)111 wurde über Nacht in Todd-Hewitt-Bouillon (THB) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Über Nacht wurden Bakterienkulturen zentrifugiert und mit PBS gewaschen, bevor die Bakterienkonzentration durch OD600-nm-Messung bestimmt wurde. Pseudomonas aeruginosa wurde vor der Infektion auf eine Konzentration von 5 × 106 KBE/ml und Streptococcus pneumoniae auf eine Konzentration von 7,5 × 106 KBE/ml in antibiotikafreiem AO-Medium verdünnt. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden apikale NPOs in Suspension für 1 Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 infiziert. Nach einstündiger Inkubation wurden infizierte NPOs dreimal mit adDMEM/F12 und 1 % P/S gewaschen. Anschließend wurden die NPOs erneut in 75 % Matrigel eingebettet und mit 30 µl pro Organoidtröpfchen auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen ausgesät. 500 µl AO-Medium (antibiotikafrei) mit 300 µg/ml Gentamicin wurden in jede entsprechende Vertiefung gegeben, nachdem sich das Matrigel verfestigt hatte. Zelllysate wurden in Puffer RLT mit β-Mercaptoethanol bei 6 hpi für qPCR-Analysen gesammelt. Zellkulturüberstände wurden bei 6 hpi zum Nachweis sekretorischer Zytokine und Chemokine mithilfe von Luminex-Assays gesammelt.

In Matrigel oder Suspension kultivierte Atemwegsorganoide (AOs) wurden mit einem inversen Nikon-Mikroskop Eclipse Ti-U Nikon in der ABSL3-Anlage unter den angegebenen Vergrößerungen abgebildet und/oder gefilmt.

Intakte Organoide wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd fixiert, anschließend mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang mit 0,2 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Anschließend erfolgte eine einstündige Blockierung mit Färbepuffer (1 % BSA, 0,2 % Triton X-100 in PBS). Als nächstes wurden die Organoide mit Primärantikörpern, einschließlich Anti-ACE2, Anti-acetyliertem Tubulin, Anti-MUC5AC, Anti-TP63 und Anti-SCGB1A1, verdünnt in Färbepuffer, 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Mit AlexaFluor 488, 594 oder 647 markierte Sekundärantikörper, Phalloidin und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Organoiden inkubiert. Organoide wurden mit dem Antifade-Eindeckmittel ProLong™ Glass auf Objektträger montiert und mit Glasdeckgläsern abgedeckt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 800-Mikroskop aufgenommen und mit der ZEN Image Analysis-Software (Zeiss) verarbeitet. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Antikörpern sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt und alle in dieser Studie verwendeten Primärantikörper wurden überprüft ((Ergänzende Abbildungen 13, 14).

Die Gesamt-RNA von NPOs und BOs mit bzw. ohne Infektion wurde mit dem RNeasy Plus Mini Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend wurde eine reverse Transkription mit dem PrimeScript RT Reagent Kit durchgeführt, um cDNA unter den folgenden Bedingungen zu erzeugen: 15 Minuten bei 37 °C, 5 Sekunden bei 85 °C, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C. Die cDNA wurde mit dem GoTaq® qPCR SYBR green Master Mix unter den folgenden Bedingungen verdünnt und amplifiziert: 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden für insgesamt 40 Zyklen. Das SARS-CoV-2 N-Gen wurde mit dem GoTaq® Probe qPCR Master Mix unter den gleichen Bedingungen amplifiziert. Die in dieser Studie verwendeten Primer- und Sondensequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 zusammengefasst. Die qPCR-Amplifikation mit SARS-CoV-2-infizierten Proben wurde auf einem Echtzeit-PCR-Nachweissystem CFX96 Touch (Bio-Rad) innerhalb der ABSL3-Einrichtung durchgeführt, während dies nicht der Fall war -SARS-CoV-2-bezogene Arbeiten wurden auf einem QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR-System (Thermofisher Scientific) durchgeführt. Die absolute Quantifizierung wurde für die folgenden Gene durchgeführt: TP63, SCGB1A1, FOXJ1, MUC5AC, ACE2, TMPRSS2, Furin, Neuropilin-1 und das SARS-CoV-2 N-Gen unter Verwendung von Standardkurven, die mit Plasmid-DNA erstellt wurden. Es wurden relative Mengen der P. aeruginosa 16 S-, S. pneumoniae lytA-, IL-1β-, IL-6-, IL-8-, IFN-β-, TNF-α-, CCL2-, CCL5- und CXCL10-mRNA (normalisiert mit β-Actin) bestimmt unter Verwendung der 2−ΔΔCt-Methode112.

Zellkulturüberstände von SARS-CoV-2-infizierten NPOs und BOs bei 48 und 72 hpi und P. aeruginosa und S. pneumoniae-infizierten NPOs bei 6 hpi wurden einem Multiplex-Zytokin-Assay unter Verwendung eines Bio-Plex Pro Human-Zytokin-Screening-Panels unterzogen ( Biorad), das laut Herstellerangaben 48 menschliche Zytokine enthält. Die spektralen Intensitäten wurden auf einem MagPix-Gerät (Luminex Corporation) und einem Bio-Plex 200-System (Bio-Rad) für Studien zu SARS-CoV-2 bzw. bakteriellen Infektionen quantifiziert. Die Zytokinkonzentrationen wurden durch Interpolation aus Standardkurven durch 5PL-Kurvenanpassung berechnet.

Die µOCT-Technologie wurde bereits beschrieben113,114,115,116. Kurz gesagt, das µOCT-System umfasste eine Spektraldomänen-OCT-Bildgebungskonsole (SD-OCT) und eine Tischsonde. Eine Superkontinuumslichtquelle beleuchtete einen 50/50-Strahlteiler. Die Hälfte des Quelllichts wurde zur Tischsonde übertragen und das von der Sonde zurückgegebene Licht wurde an ein Spektrometer weitergeleitet. Das Spektrometer bestand aus einem holographischen Phasentransmissionsgitter mit 960 Linien/mm Volumen, einem Kameraobjektiv mit mehreren Elementen und einer Zeilenkamera. Das vom Referenzarm reflektierte Licht und das vom Probenarm zurückgestreute Licht wurden mit dem Strahlteiler zurück zur Konsole kombiniert. Das Querscannen (x, y) wurde mit einem Paar Galvanometerscannern durchgeführt, die von einer analogen Ausgangsplatine angetrieben wurden. Die Ausgabe der Kamera wurde an eine Bilderfassungskarte übertragen.

Die µOCT-Bildgebung wurde an menschlichen BOs durchgeführt, wobei die Beleuchtung von oben auf die Organoide fiel. Die Achse der Abbildungsoptik wird typischerweise innerhalb von 10° von der Normalen zur Zellebene platziert, um Fehler bei geometrischen Messungen zu minimieren. Die Zilienschlagfrequenz (CBF) wird anhand einer Zeitreihe von Bildern bestimmt und durch Quantifizierung der Häufigkeit der Spitzenamplitude in den Bildregionen, die oszillierendes Verhalten zeigen, beurteilt. Im Durchschnitt werden pro Spender 6 bis 10 Organoide in bis zu 10 Regionen mit Ziliaraktivität pro Bildsequenz ausgewertet, um CBF zu bestimmen. Die gesamte Bildanalyse wurde mit ImageJ und MATLAB durchgeführt.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde gemäß dem Standardprotokoll des Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM Library & Gel Bead Kit V3.1 gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, NPOs und BOs wurden einmal mit adDMEM/F12 gewaschen, um Matrigel zu entfernen, und dann 10 Minuten lang mit TrypLE Express inkubiert. Als nächstes wurden Einzelzellsuspensionen durch wiederholtes Durchlaufen der großen undissoziierten Strukturen mit einer P1000-Spitze erreicht. Einzelne Zellen wurden zentrifugiert und zur Zellzählung in AO-Medium resuspendiert, um eine Dichte von 1000 Zellen/µl zu erhalten. Die Zellen wurden auf den Chromium Next GEM-Chip G geladen und auf dem Chromium-Controller ausgeführt. Sequenzierungsbibliotheken wurden gemäß dem Standardprotokoll des Herstellers erstellt. Die DNA-Bibliotheken wurden auf einer Illumina HiSeq2500 v2-Plattform (28 x 91 bp) in der Sequenzierungsanlage am Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering (SCELSE) der Nanyang Technological University, Singapur, paarweise sequenziert und einzeln indiziert.

Rohe Fastq-Reads von NPOs und BOs von nicht erkrankten und COPD-Patienten wurden mithilfe von Cell Ranger 6.0.2 mit dem menschlichen GRCh38-Referenzgenom abgeglichen. Die einzelnen Zellzahlmatrizen wurden dann mit Seurat 4.0117 analysiert. Zellen mit <200 nachgewiesenen Genen und >20 % mitochondrialen Genen wurden ausgeschlossen. Die gefilterten Datensätze wurden dann mithilfe der SCTransform-Funktion in Seurat normalisiert und integriert, um ein einheitliches Datenarray für die nachgelagerte Vergleichsanalyse zwischen nicht erkrankten Patienten (Zusammenfassung einer NPO-ND-Linie und einer BO-ND-Linie) und COPD (Zusammenfassung einer NPO) zu erhalten -COPD-Linie und eine BO-COPD-Linie).

Die Zellclusterung wurde mit einem Auflösungsparameter von 0,3 durchgeführt. Die nichtlineare Dimensionsreduktion wurde verwendet, um die einheitlichen und krankheitszustandsspezifischen UMAP-Diagramme wie dargestellt zu erstellen. Die Analyse der differentiellen Expression wurde basierend auf nichtparametrischen Wilcoxon-Rangsummentests mit den Funktionen FindAllMarkers und FindMarkers von Seurat durchgeführt, um Genmarker jedes Zellclusters und differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen den nicht erkrankten und den COPD-Zellen zu identifizieren. Die Analyse der funktionellen Anreicherung wurde mit Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) und GSEA118 durchgeführt. Um unsere COPD-Organoidmodelle zu validieren, haben wir die am häufigsten angereicherten Funktionen, basierend auf DEGs, aus öffentlich zugänglichen veröffentlichten Massen-RNAseq-Datensätzen kultivierter Atemwegsepithelzellen und/oder klinischer Biopsien von COPD mit denen aus unseren scRNA-seq-Datensätzen verglichen119. Drei relevante Datensätze (Zugangsnummern: GSE124180, GSE146532 und GSE162154) wurden identifiziert und mit Rsubread 3.6.2 dem Ensembl-Gen ID120 zugeordnet. GSE124180 und GSE146532 mussten jedoch ausgeschlossen werden, da ihre nicht erkrankten und COPD-Probensätze keine unterschiedlichen Cluster bildeten voneinander basierend auf der Hauptkomponentenanalyse (PCA). Daher wurde für unsere Vergleichsanalyse nur GSE162154 verwendet. Die Massen-RNAseq-Datensätze wurden von Gene Expression Omnibus (GEO) heruntergeladen.

Die Zelltypanmerkung wurde zunächst mithilfe von Blueprint, ENCODE und den Human Primary Cell Atlas-Datenbanken mithilfe von Celldex (1.2.0) analysiert, was bestätigte, dass alle Zellen einen epithelialen Phänotyp aufwiesen121. Um den Zelltyp des jeweiligen Clusters zu bestimmen, wurde GSEA verwendet, um Vergleiche mit den Atemwegs- bzw. Lungenzellsignatur-Gensätzen von Garcia et al. anzustellen. (2019)36 und Travaglini et al. (2020)37 bzw. Die Pseudozeitanalyse wurde unter Verwendung von Monocle3122 durchgeführt und die Zelltrajektorie wurde mit den zyklischen Basalzellen abgeleitet, die als Wurzelknoten angegeben wurden (Ursprung der Trajektorie; Pseudozeit = 0).

Nicht erkrankte und COPD-NPOs wurden entweder scheinbehandelt oder 6 Stunden lang mit Pseudomonas aeruginosa (PAO1) infiziert. Anschließend wurden die Organoide mit Qiagen RLT plus Puffer lysiert und die RNA mit dem Qiagen RNeasy Plus Mini Kit isoliert. Gestrandete mRNA-Bibliotheken für jede Probe wurden mit Oligo-dT-Reinigung unter Verwendung des Illumina TruSeq Stranded mRNA Kit hergestellt. Die Bibliotheken wurden mithilfe des Illumina HiSeq2500-Systems mit 100 bp (PE100) am gepaarten Ende sequenziert.

Rohe Paired-End-Sequenzierungsdaten im FASTQ-Format (verfügbar in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank von NCBI: GSE201465 wurden mit trimmomatic-0.39 auf Adaptersequenz/Sequenz geringer Qualität zugeschnitten (Parameter: /trimmomatic-0.39/adapters/TruSeq3-PE- 2.fa:2:30:10:1:TRUE LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:30). Die Qualität der Sequenzlesevorgänge nach dem Trimmen wurde mit FastQC v0.11.8 überprüft. Anschließend wurden getrimmte Sequenzlesevorgänge zugeordnet das menschliche Referenzgenom GRCh38.p13 (hg38) unter Verwendung der in Rsubread v2.6.4 verfügbaren Align-Funktion, die in der Software R v4.1.0 ausgeführt wurde (Parameter: Typ = rna). Die Extraktion der Merkmalsanzahl wurde mit der in Rsubread v2 verfügbaren FeatureCounts-Funktion durchgeführt .6.4, das dann in der Software R v4.1.0 ausgeführt wurde (Parameter: annot.ext=hg38.ensGene.gtf, isGTFAnnotationFile=TRUE, isPairedEnd=TRUE).

Die differenzielle Genexpression wurde mit DESeq2 (v1.34.0)123 durchgeführt. Gene galten als differenziell exprimiert, wenn die log2-Fold Change >± 1 und der angepasste p-Wert <0,05 war. Alle unterschiedlich exprimierten Gene (DEGs) zwischen scheinbehandelten und mit P. aeruginosa infizierten, nicht erkrankten und COPD-NPOs unterlagen einer hierarchischen Clusterbildung basierend auf ihrem Expressionstrend, um 5 Hauptgencluster zu bilden. Die angereicherten Genontologiebegriffe jedes Genclusters wurden mit ViSEAGO124 analysiert.

Für nicht infektionsbezogene Experimente, die in den Abbildungen beschrieben werden. 1–3, n = 7; n = 10; n = 3 und n = 8 biologisch unabhängige Replikate wurden für NPO-nicht erkrankte (ND) verwendet; NPO-COPD; BO-ND bzw. BO-COPD. Für die in den Abbildungen beschriebenen Infektionsstudien. 4–6, mindestens n = 3 biologisch unabhängige Replikate wurden durchgeführt. Die Daten wurden mit der GraphPad Prism-Software (Version 8.3.0) analysiert. Kontinuierliche Daten wurden mit dem Kolmogorov-Smirnoff-Test (KS-Test) auf Normalität getestet. Die Daten werden als Mittelwert mit Standardfehler für normalverteilte Daten dargestellt und ein Student-t-Test oder eine Varianzanalyse (ANOVA) wird verwendet, um gegebenenfalls Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln. Für nicht normale Variablen werden die Mediane mit dem Interquartilbereich dargestellt und beim Vergleich zweier Gruppen der Wilcoxon-Signed-Rang-Test (gepaarte Daten) und der Mann-Whitney-U-Test (ungepaarte Daten) und/oder der Kruskal-Wallis-Test für > 2 Gruppen durchgeführt , jeweils. Spearman-Korrelationskoeffizientenanalysen (nichtparametrisch) wurden durchgeführt, um Korrelationen zwischen spezifischen Genexpressionsniveaus und dem forcierten Exspirationsvolumen in der ersten Sekunde des vorhergesagten Prozents (FEV1 % vorhergesagt) zu ermitteln. Ein p-Wert <0,05 wurde als signifikant angesehen und der Grad der Signifikanz wurde wie folgt dargestellt: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 und ****P < 0,0001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung: Rohe Fastq-Reads von NPOs und BOs von nicht erkrankten und COPD-Patienten wurden mit dem menschlichen GRCh38 abgeglichen. p13 (hg38) Referenzgenom. Drei öffentlich zugängliche veröffentlichte Massen-RNAseq-Datensätze ((Zugangsnummern: GSE124180, GSE146532 und GSE162154) von kultivierten Atemwegsepithelzellen und/oder klinischen Biopsien von COPD wurden zum Vergleich mit unserem scRNA-Datensatz verwendet. Die 10-fachen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurden in generiert Diese Studie wurde in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE186017 hinterlegt.

Massen-RNA-Sequenzierung: Rohe FASTQ-Reads wurden dem menschlichen Referenzgenom GRCh38.p13 (hg38) zugeordnet. Die in dieser Studie generierten Massen-RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE201465 hinterlegt.

Alle weiteren relevanten Daten, die die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

R-Skripte für die Einzelzell-RNA-seq-Analyse sind unter https://github.com/chenghongsheng/SC_RNAseq-airway-organoid und https://doi.org/10.5281/zenodo.7290276 verfügbar.

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Diese Forschung wurde von der National Research Foundation Singapore im Rahmen ihres COVID-19-Forschungsfonds unterstützt, der vom National Medical Research Council (MOH-000409) (an SHC) und dem National Medical Research Council COVID19RF2-0006 (an LF.W.) des Gesundheitsministeriums von Singapur verwaltet wird und DEA) und vom National Medical Research Council des Gesundheitsministeriums von Singapur im Rahmen seines Clinician Scientist Award (CSA) (MOH-000710) (SHC). LLYC wird von der Lee Kong Chian School of Medicine der Nanyang Technological University im Rahmen des Dean's Postdoctoral Fellowship und des Wong Peng Onn Fellowship (002823-00001) unterstützt. Wir danken Herrn Ter Soo Kai von der Lee Kong Chian School of Medicine der Nanyang Technological University für seine Unterstützung bei Vero-E6-Zellkulturen. Wir danken Herrn Mervyn Ong vom Singapore General Hospital für seine Unterstützung bei der Koordinierung der Entnahme und des Transports von Nasopharynxabstrichen. Wir danken Dr. Viji Vijayan und Herrn Benson Ng von der ABSL3-Einrichtung der Duke-NUS Medical School für das Logistikmanagement und die Unterstützung. Die Autoren danken dem TARIPH Center of Respiratory Research Excellence für die Unterstützung der Zusammenarbeit. Schematische Darstellungen in Abb. 1a, 4a, b und 6a wurden mit BioRender.com erstellt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lin-Fa Wang, Sanjay H. Chotirmall.

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Louisa LY Chan, Hong Sheng Cheng, Francis Xavier Ivan, Pei Yee Tiew, Tsin Wen Yeo, Nguan Soon Tan und Sanjay H. Chotirmall

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Lin-Fa Wang

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Sanjay H. Chotirmall

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LLYC, LF.W. und SHC konzipierte die Studie; LLYC etablierte die Organoide der menschlichen Atemwege, führte Experimente zu viralen und bakteriellen Infektionen, konfokale Bildgebung und Datenanalyse durch; DEA, AEZK, RF und AMG führten Virusinfektionsexperimente und Datenanalysen durch; LLYC und HSC führten die Vorbereitung der Einzelzellbibliothek durch; HSC, FXI und NST führten Einzelzell- und Bulk-RNA-Transkriptomanalysen durch; SC und LL führten die μOCT-Bildgebung und -Analyse durch; TPY, MSK, KCH L und YTW sammelten klinische Proben; BGO und PABW stellten die Bronchialproben zur Verfügung. KN und PSP kultivierten die menschlichen Bronchialepithelzellen; YLC führte eine Immunfärbung zur Überprüfung der Antikörper durch; LLYC und SHC haben das Manuskript geschrieben; Alle Autoren haben zur Bearbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Louisa LY Chan oder Sanjay H. Chotirmall.

SHC ist Mitglied in Beiräten von CSL Behring, Pneumagen Ltd und Boehringer Ingelheim, hat Vortragshonorare von Astra-Zeneca erhalten und ist Mitglied im Data and Safety Monitoring Board (DSMB) von Inovio Pharmaceuticals und der Imam Abdulrahman Bin Faisal University, alles außerhalb der eingereichten Arbeiten . Alle anderen Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 25. Oktober 2021

Angenommen: 22. November 2022

Veröffentlicht: 10. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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