Magnetofektionsansatz zur Transformation von Okra unter Verwendung grüner Eisennanopartikel

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 16568 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Klimawandel, Pestizidresistenz und die Notwendigkeit, neue Pflanzensorten zu entwickeln, haben Biotechnologen dazu veranlasst, neue Lösungen für die Produktion transgener Pflanzen zu finden. Im letzten Jahrzehnt arbeiten Wissenschaftler an grünen metallischen Nanopartikeln, um DNA-Abgabesysteme für Pflanzen zu entwickeln. In der aktuellen Studie wurden grüne Eisennanopartikel unter Verwendung von Blattextrakt von Camellia sinensis (grüner Tee) und Eisenchlorid (FeCl3) synthetisiert, die Charakterisierung und Bestätigung erfolgte mittels UV-VIS-Spektroskopie, FTIR, SEM und TEM. Unter Verwendung dieser Nanopartikel wurde eine neuartige Methode zur Gentransformation in Okra-Pflanzen mit einer Kombination verschiedener Magnetofektionsfaktoren entwickelt. Die maximale Gentransformationseffizienz wurde bei einem Verhältnis von DNA zu Eisen-Nanopartikeln von 1:20 durch Rotation der Mischung (Plasmid-DNA, Eisen-Nanopartikel und Samenembryo) bei 800 U/min für 5 Stunden beobachtet. Mit diesem Ansatz konnte die Transformation des GFP-Gens (grün fluoreszierendes Protein) in Abelmoschus esculentus (Okra-Pflanze) erfolgreich durchgeführt werden. Die DNA-Transformation wurde durch Beobachtung der Expression von transgenem GFP mittels konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) und PCR bestätigt. Diese Methode ist äußerst wirtschaftlich, anpassungsfähig, genotypunabhängig, umweltfreundlich und zeitsparend. Wir schließen daraus, dass dieser Ansatz eine potenzielle Lösung zur Bekämpfung der Ertrags- und Immunitätsprobleme von Pflanzen gegen Krankheitserreger sein kann.

Fortschritte in der Medizin und der weit verbreitete Einsatz von Medikamenten haben zu Resistenzen bei menschlichen und pflanzlichen Krankheitserregern geführt. Daher besteht die Notwendigkeit, neue transgene Pflanzensorten zu entwickeln, die dem sich ändernden Klima standhalten und dem Angriff von Krankheitserregern widerstehen können. Es bedarf jedoch einer präzisen Methode, mit der fremde DNA erfolgreich in die Pflanzen eingeschleust werden kann. In diesem Zusammenhang wurden im Laufe des 19. Jahrhunderts viele Methoden der genetischen Transformation entwickelt, wie die biolistische Methode (Genkanone)1, Elektroporation2, Sonoporation3, Transfektion4, Magnetofektion5, Protoplastenfusion6, Mikroinjektion7, Vakuuminfiltration8 und Agrobacterium-vermittelte Transformation9 usw . Jede genetische Transformationsmethode, ob chemisch, physikalisch oder biologisch, unterliegt bestimmten Einschränkungen10. Beispielsweise kann Elektroporation die DNA schädigen oder dazu führen, dass sie ihre Integrität verliert11. Ebenso ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation keine zielspezifische Methode12. All diese Einschränkungen haben Biologen dazu gedrängt, neue Lösungen für die DNA-Übertragung zu entwickeln.

Überall auf der Welt gibt es große Bedenken hinsichtlich der Umweltrisikobewertung verschiedener gentechnisch veränderter Pflanzen13. Daher ist es wichtig, sich den Techniken zuzuwenden, die das minimale Risiko bergen. Seit dem letzten Jahrzehnt werden grüne Eisen-Nanopartikel (GINPs) synthetisiert und in verschiedenen Bereichen wie der Medizin, der antimikrobiellen Aktivität, der Kontrolle der Umweltverschmutzung und dem Abbau von Azofarbstoffen usw. verwendet.14,15,16,17. Die grüne Synthese ist eine alternative Methode zu chemischen und physikalischen Methoden, da sie wirtschaftliche und ökologische Vorteile bietet18. Allerdings ist sein Einsatz bei der Gentransformation zur Behandlung menschlicher Krankheiten recht neu19. GINPs verfügen über die Fähigkeit zur DNA-Bindung, die zur Entwicklung von DNA-Abgabesystemen genutzt werden kann20,21. Tatsächlich nutzt dieses System die Magnetofection-Technik zur Gentransformation sowohl in Pflanzen als auch in Tumorzellen22.

In jüngster Zeit werden Pflanzenextrakte in großem Umfang bei der Synthese von GINPs verwendet, die den metallischen Nanopartikeln mehr Stabilität verleihen23. Valentine V. et al. schlugen in ihrer Untersuchung der Biosynthese von Eisenoxid-Nanopartikeln vor, dass die Anwesenheit organischer Säuren (wie Zitronen- oder Oxalsäure) hauptsächlich zur Stabilisierung von Eisen-Nanopartikeln beiträgt und Pflanzen mit diesen organischen Säuren hochstabile Eisen-Nanopartikel produzieren können24. In Pflanzenextrakten sind viele organische Verbindungen (wie Flavonoide, Alkaloide und Saponine usw.) enthalten, die den GINPs eine bessere Löslichkeit und Kompatibilität verleihen25. Darüber hinaus reduzieren GINPs das Risiko einer Umwelttoxizität; da die Beschichtung von Metallpartikeln mit anderen nicht biologisch abbaubaren Polymeren schädlich sein kann26. Daher sind die metallischen Nanopartikel, die unter Verwendung von Pflanzenextrakten hergestellt und als DNA-Abgabesystem in Pflanzen verwendet werden, viel effizienter als die magnetischen Nanopartikel (MNPs), die mit synthetischen Polymeren hergestellt werden.

In der aktuellen Studie haben wir die GINPs mit Blattextrakt von Camellia sinensis hergestellt. Die Optimierung der Magnetofection wurde durchgeführt, um die DNA-Lieferung über GINPs zu verbessern. Wir haben das GFP-Gen im Abelmoschus esculentus (Okra) erfolgreich transformiert. In der Studie wurden grüne Teeblätter verwendet, da sie organische Säuren (wie Zitronen- oder Oxalsäure) enthalten, die die Produktion stabiler Eisennanopartikel unterstützen. Um die Landwirtschaft zu revolutionieren, kann diese neuartige Methode zur Übertragung von Genen in Pflanzen eingesetzt werden.

Die Blätter der Grünteepflanze wurden großzügigerweise von Arif Ahmed (Botanischer Garten, Universität des Punjab) zur Verfügung gestellt und die Okra-Samen wurden freundlicherweise von Dr. Atif Kamran (Seed Centre, Department of Botany, University of the Punjab) zur Verfügung gestellt. Alle in dieser Studie beschriebenen experimentellen Arbeiten an Pflanzenmaterial entsprechen den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen.

Die Eisen-Nanopartikel wurden mit der von Wang et al. beschriebenen Methode synthetisiert und charakterisiert. mit geringfügigen Änderungen27. Zur Herstellung von GINPs wurden getrocknete Blätter (2 g) der Grünteepflanze (C. sinensis) in 100 ml entionisiertem, autoklaviertem Wasser gemischt/eingeweicht. Die Mischung wurde 20 Minuten lang im Wasserbad auf 80 °C erhitzt und über Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert. Später wurde eine 0,1 M wässrige Lösung von Eisenchlorid (FeCl3) in 100 ml entionisiertem autoklaviertem Wasser hergestellt. Danach wurde das Filtrat aus Grüntee-Lösung und FeCl3-Lösung in gleichen Volumenanteilen vermischt. Um schließlich Eisen-Nanopartikel zu erhalten, wurde die Mischung 15 Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Zur Anwendung wurde das Pellet mit entionisiertem autoklaviertem Wasser gewaschen (Abb. 1a–c).

Vorbereitung von GINPs. (a) Grüntee-Blattextrakt, 0,1 M FeCl3-Lösung und Eisen-Nanopartikel. (b, c) synthetisiertes Eisen-Nanopartikel-Pellet nach Zentrifugation.

Zur ersten Identifizierung wurden die erhaltenen Nanopartikel einer UV-Vis-Spektroskopie (Ultraviolett-Vis-Spektroskopie)28 unterzogen. Zur Bestätigung wurden Nanopartikel mittels FTIR (Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie), SEM (Rasterelektronenmikroskop) und TEM (Transmissionselektronenmikroskop) analysiert.

Der MTT-Assay wurde zur Zytotoxizitätsanalyse von Eisennanopartikeln durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden J774-Zellen in 96-Well-Platten gezüchtet. Mit Tween 80 beschichtete Eisennanopartikel wurden in definierten Konzentrationen (25, 100, 200, 300, 400 und 500 μg/ml) zu den Zellen gegeben und drei und sechs Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium verworfen und den Zellen nach gründlichem Waschen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung 90 μl frisches Medium pro Vertiefung zugesetzt. Anschließend wurden 10 μl (5 mg/ml Stammlösung) MTT-Reagens (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in die Vertiefungen gegeben und die Platte sechs Stunden lang in einem Inkubator inkubiert . Nach der Inkubation wurden die Medien aus den Vertiefungen verworfen und 100 μl Dimethylsulfoxid wurden zugegeben, um die gebildeten Formazankristalle zu solubilisieren. Anschließend wurden die Messwerte in einem Enzymimmunoassay-Lesegerät bei 490 nm gemessen, wobei die Plattenabsorption bei 650 nm abgezogen wurde29. Die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Verhältnis der mittleren Absorption von dreifachen Messungen zur mittleren Absorption der Kontrollvertiefungen berechnet:

In der vorgestellten Studie wurde das Plasmid pBIN.35 s-mgfp5-ER (Abbildung S1) verwendet30, das ein modifiziertes GFP-Gen trägt. GFP ist ein Reportergen mit 717 bp und kann im UV- (395 nm) oder blauen Licht der Wellenlänge 437 nm sichtbar gemacht werden. Sein Promoter-Reporter-Name ist CaMV: GFP und seine Auswahl ist Kanamycin (SnapGene).

Okra-Samen wurden über Nacht in Wasser eingeweicht und dann 20 Minuten lang einer Oberflächensterilisation mit 5 % Natriumhypochlorit unterzogen. Zur Gewinnung des Embryos wurde die Samenschale entfernt (Abb. 2a–c).

Schematische Darstellung der Transformationsschritte. (a) Keimung der Okra-Samen; (b) Isolierung des Embryos; (c) Isolierter Embryo; (d) Bildung des Plasmid-Eisen-Nanopartikel-Komplexes; (e) Inkubation von Embryonen in MS-Medium; (f) Embryo im Aufnahmemedium; (g) Pflanzen in Wurzelmedien; (h) Pflanzen nach 15 Tagen; (i) und verschiedene Pflanzenstadien.

Zur Bildung eines Plasmid- (pBIN.35 s-mgfp-ER)-Eisen-Nanopartikel-Komplexes wurden Plasmid und Nanopartikel in Eppendorf gegeben, gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die isolierten Embryonen wurden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einem Plasmid-Eisen-Nanopartikel-Komplex getaucht (Abb. 2d). Um ein Magnetfeld bereitzustellen, wurde das Eppendorf in einen Becher mit Magnetkügelchen (Thermo Scientific™ Nalgene™-2,125 Zoll Magnetkügelchen, Katalognummer: DS6630-0250) gehängt. Das Becherglas wurde bei einer bestimmten Drehzahl und Zeit in den Magnetrührer gestellt (Abb. 3).

Magnetofektion: Veranschaulichung der DNA-Abgabe mithilfe von GINPs.

Unter Berücksichtigung der drei Faktoren DNA-Nanopartikel-Verhältnis (DNR), Magnetfeldzeit (für die Magnetofektion verwendet) und Umdrehung pro Minute (U/min) wurden 27 Behandlungen mit 10 Wiederholungen entworfen. Jede Behandlung wurde einer anderen Kombination aus DNR, U/min und Magnetfeldzeit unterzogen (Tabelle 1).

Der Eppendorf (enthaltend GINPs und Okra-Embryo) wurde in einem Becher aufgehängt. Das Becherglas wurde auf einen Magnetrührer gestellt, um ein Magnetfeld bereitzustellen und mit einer bestimmten Drehzahl und Zeit zu rühren. Die Illustration wurde mit dem Online-BioRender-Tool (https://biorender.com/) erstellt.

Das MS-Medium (Murashige und Skoog), das Kanamycin enthielt, wurde verwendet, um den Embryo unter Verwendung der Gewebekulturröhrchen zu züchten. Der Embryo wurde unter sterilisierten Bedingungen eines laminaren Luftstroms in das Basalmedium gelegt (Abb. 2e). Anschließend wurden die Röhrchen 21 Tage lang bei 28 °C in einer Pflanzenwachstumskammer inkubiert (Abb. 2f – i). Nach der Keimung wurde das Vorhandensein von GFP in der Okra-Pflanze mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) (Abb. 4a, b) und durch die Amplifikation des GFP-Gens (Abb. 4c und Abb. S2) mittels Polymerasekettenreaktion überprüft ( PCR).

Die Bestätigung der GFP-Gentransformation mittels konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop und PCR (a, b). Die grüne Fluoreszenz in transgenen Okra-Pflanzen bestätigte die Genübertragung und die erfolgreiche Expression des GFP-Gens. (c) Die PCR-Amplikons entsprachen im Vergleich zur DNA-Leiter, die die Abgabe des GFP-Gens bestätigt, ebenfalls 200 bp.

Für die Amplifikation von DNA wurden spezifische Primer (Vorwärts: 5′-ATGAGTAAAGGAGAAGAA-3′, Rückwärts: 3′-CATAAGAGAAAGTAGTG-5′) entwickelt, um die ersten 200 bp des mgfp5-Gens zu amplifizieren. Für die PCR wurde eine Reaktionsmischung von 25 µL mit 3 µL (20 ng/µL) Template-DNA, 2,5 µL 10 × Taq-Polymerase-Puffer (Fermentas, MA, USA), 2,5 µL dNTPs (2 mM), MgCl2 ( 1,5 mM), 2 µL Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 0,25 µl Taq-Polymerase (Fermentas, MA, USA).

Der Thermocycler war für den anfänglichen Abbau bei 94 °C für 2 Minuten programmiert, gefolgt von 35 Zyklen (94 °C für 30 Sekunden, 58 °C für 30 Minuten und 72 °C für 45 Sekunden). Die letzte Verlängerung erfolgte für 10 Minuten bei 72 °C. Zur Bestätigung wurden die PCR-Amplikons auf 1 % Agarosegel (Ethidiumbromid; 0,5 μg/ml) laufen gelassen und die DNA-Banden wurden mit dem digitalen Geldokumentationssystem beobachtet (Abb. 4c).

Die Daten von 270 Embryonen wurden einer Varianzanalyse (ANOVA) (Abb. 5) unterzogen, gefolgt von Fishers Protected Least Significant (LSD)-Differenztest mit einem Wahrscheinlichkeitsniveau von 5 % unter Verwendung der Software Statistix 8.1 (https://www.statistix). com/). Die Größe der GINPs wurde mithilfe eines TEM-Bildes mit Hilfe von ImageJ (https://imagej.net) gemessen und die Häufigkeiten der Größe wurden mit OriginLab (https://www.originlab.com) berechnet.

Die Wirkung verschiedener Behandlungen auf die Genabgabe. Drei Faktoren: Verhältnis von DNA zu Nanopartikeln (DNR), Zeit der Magnetofektion (h) und Umdrehung pro Minute (U/min). Die Behandlung Nr. 14 ergab die höchste Anzahl an transgenen Pflanzen, die eine DNR-Ration von 1:20 und eine 5-stündige Magnetofektion mit 800 U/min umfassten.

Bei der Untersuchung der UV-VIS-Spektroskopie (Abb. 6a) zeigten die Eisen-Nanopartikel Spektren zwischen 350 und 450 nm, die die Bildung von Eisen-Nanopartikeln bestätigen. Das FTIR-Spektrum (Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie) grüner Eisen-Nanopartikel ist in (Abb. 6b) dargestellt.

Das UV-VIS- (a) und FTIR-Spektrum (b) der grünen Eisen-Nanopartikel. (a) Die Absorption von grünen Eisen-Nanopartikeln war bei 395 nm maximal und dieser Bereich bestätigt das Vorhandensein eines Fe-Cl-Komplexes in der Probe16. (b) Das FTIR-Spektrum von Nanopartikeln zeigt das Vorhandensein von Banden bei 3410, 2924, 2050, 1633, 1041, 671 und 599 cm−1.

Das FTIR-Spektrum von Nanopartikeln weist auf das Vorhandensein von Banden bei 3410, 2924, 2050, 1633, 1041, 671 und 599 cm−1 hin. Die genannten Banden können auf N-H-Streckung, -CH-, N=C-, C=C- und C-Cl-Bindungen zurückzuführen sein. Das Vorhandensein von C-Cl-Bindungen im Fingerabdruckbereich des Spektrums (1041, 671 und 599 cm−1) bestätigt die Bindung von FeCl3 mit dem Extrakt aus grünem Tee. Die höchsten Häufigkeiten der GINP-Größe lagen zwischen 7,5 und 12,5 nm, wie in Abb. 7c dargestellt. Die mikroskopische Aufnahme von SEM und TEM ist in (Abb. 7a, b) dargestellt.

Die SEM- und TEM-Analyse von GINPs und die Größenverteilung von GINPs. (a) Zeigt das SEM und (b) hebt die TEM-Analyse von GINPs hervor. (c) Das Histogramm zeigt, dass die Größe der GINPs im Bereich von 5–40 nm lag. Die höchsten Frequenzen lagen jedoch zwischen 7,5 und 12,5 nm.

Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigten, dass Zellen, die drei und sechs Stunden lang GINPs mit einer mittleren Größe von 30 nm ausgesetzt waren, zu zeitabhängiger und konzentrationsabhängiger Zytotoxizität führten. Bei einer Konzentration von 25 μg/ml betrug die Lebensfähigkeit der Zellen nach drei und sechs Stunden 100 % bzw. 95 %. Mit zunehmender GINP-Konzentration (25, 100, 200, 300, 400 und 500 μg/ml) sank die prozentuale Lebensfähigkeit innerhalb von 3 Stunden von 100 % auf etwa 75 %. Wenn die Zellen 6 Stunden lang mit der gleichen GINP-Konzentration bei 25 und 100 μg/ml inkubiert wurden, war die Lebensfähigkeit der Zellen ähnlich wie nach drei Stunden. Im Gegensatz dazu nahm die Lebensfähigkeit bei 200 μg/ml und höheren Konzentrationen deutlich ab und lag zwischen 55 und 65 % (Abb. 8).

Die Zytotoxizitätsanalyse von GINPs. Die Auswirkungen superparamagnetischer Eisenoxid-Nanopartikel auf die Zellproliferation und Lebensfähigkeit von J774-Zellen, bestimmt durch MTT-Assay. Konzentrationsabhängige zytotoxische Wirkungen von Nanopartikeln, bewertet nach drei und sechs Stunden Inkubation. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. *Signifikanter Unterschied zur Kontrolle (P < 0,05).

Die Abgabe des GFP-Gens in Pflanzen ab Behandlung Nr. 14 wurde bestätigt, da die Größe der PCR-Amplifikate der Zielgröße (200 bp) im Vergleich zur DNA-Leiter entsprach (Abb. 4c). Bei der Expression in Pflanzen erzeugt das GFP grüne Fluoreszenz, wenn es unter LSCM beobachtet wird. In unserer Studie bestätigte LSCM die grüne Fluoreszenz in Okra-Pflanzen (Abb. 4b). Allerdings gab es bei der Untersuchung unter LSCM keine grüne Fluoreszenz in Kontrollpflanzen (Abb. 4a).

Die statistische Analyse zeigte, dass Behandlung Nr. 14 (1 µL DNA pro 20 µL Eisen-Nanopartikel-Lösung, 5 Stunden lang bei 800 U/min dem Magnetfeld ausgesetzt) ​​produzierte die maximale Anzahl transgener Pflanzen, dh 9 von 10 waren transgen (Abb. 5). Die hohe Magnetofektionszeit und Drehzahl führten zu einer geringen Produktion transgener Pflanzen. Auch ein großer DNR steigerte die Genabgabe in die Pflanzen nicht.

Nach Beobachtung der besten Transformation von Behandlung Nr. 14 wurde das Experiment mit 30 Okra-Pflanzen, die der Behandlung Nr. 14 unterzogen wurden, erneut durchgeführt. 14, d. h. 1 µL DNA pro 20 µL Eisen-Nanopartikel-Lösung, 5 Stunden lang bei 800 U/min dem Magnetfeld ausgesetzt und nach dem gleichen Keimungsverfahren wie oben beschrieben. Die erzielten Ergebnisse zeigten eine Erfolgsquote von 90 %, da 27 von 30 Pflanzen transgen waren.

Die Gentechnik von Pflanzen hat eine neue Richtung für verbesserte Nutzpflanzen geebnet und den Fortschritt der globalen Agrarindustrie beschleunigt. Bisher wurden viele Methoden zur Gentransformation eingeführt, aber jede Methode hat ihre eigenen Einschränkungen31,32. Der Gentransport mit Hilfe metallischer Nanopartikel ist ein neuer Ansatz auf dem Gebiet der Biotechnologie. Diese metallischen Nanopartikel wurden jedoch zuvor unter Verwendung von Polymeren oder anderen Beschichtungsmaterialien synthetisiert33,34. Mehrere Berichte haben auf die Toxizität hingewiesen, die durch die Verwendung von Polymeren in nanopartikelvermittelten Arzneimittelabgabesystemen verursacht wird35,36,37. In der vorliegenden Studie haben wir die grüne Synthesemethode zur Herstellung von Nanopartikeln verwendet, da sie umweltfreundlich, weniger toxisch, stabiler und kostengünstiger ist (da anstelle von Hochenergiemaschinen und teuren Chemikalien Pflanzen verwendet werden). Vor allem ist es zeitsparend, da die grüne Synthese ein einstufiger Bioreduktionsprozess ist (Abb. 9)38.

Schematische Darstellung, die die Aufnahme des Plasmid-Nanopartikel-Komplexes durch Pflanzen zeigt.

Die Verwendung von Nanopartikeln als molekularer Transporter bei Tieren, Pflanzen und Menschen; In früheren Studien wurde über Nanomaterialien für die Gentherapie und Krebstherapie berichtet. Zu den hervorgehobenen Beispielen gehören: die Verwendung von Au-NP (Gold-Nanopartikeln) zur Stummschaltung der Polo-Loke-Kinase-1 (PKL1), die die Apoptose der beschädigten Zelle verursacht und die umliegenden Zellen vor einer Beeinträchtigung schützt. In einer anderen Studie soll die Au-NP-Abgabe an aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Zellen (MSC) verbessert werden39,40,41. Peng et al. verwendeten aus Lactoferrin extrahierte antimikrobielle Peptide zur Beschichtung von Au-NP42. Zhi et al. verwendeten Graphenoxid (GO)-Nanopartikel zur Abgabe von microRNA21 (mir21) und Adriamycin (einem Krebsmedikament) zur Überwindung der Multiresistenz von Tumoren in vitro43. Kürzlich wurde der „grüne Ansatz“ verwendet, um die superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) mit Stevia-Pflanzenextrakten zu beschichten44. Die durch grüne Ansätze erzeugten Nanopartikel weisen eine geringe Toxizität auf, sind biokompatibel und weisen eine überlegene Funktion auf.

Wir haben die Magnetofektionsmethode für die Genabgabe mithilfe der GINPs erfolgreich optimiert. Eisen(III) kann sich leicht an die DNA binden, ohne die Zellen zu schädigen, und diese Eigenschaft ist für Biotechnologen bei der Entwicklung einer Methode zur Gentransformation nützlich45. Zu diesem Zweck sind jedoch eine angemessene Magnetofektionszeit sowie eine bestimmte Anzahl von Umdrehungen und ein fester DNR erforderlich. Bezeichnenderweise zeigten unsere Ergebnisse, dass 1:20 DNR, 800 U/min für 5 Stunden optimal für die Produktion einer maximalen Anzahl transgener Pflanzen durch Genabgabe sind. Im Gegensatz dazu haben höhere Drehzahlen und höhere Zeit die Anzahl transgener Pflanzen verringert. In einer Studie kamen Lai und Singh46 zu dem Schluss, dass Eisen in Gegenwart eines Magnetfelds eine Fenton-Reaktion auslösen kann, die zu DNA-Schäden führt. Daher könnte dies der Grund dafür sein, dass bei längerer Exposition gegenüber dem Magnetfeld eine geringere Anzahl transgener Pflanzen entsteht.

Auch die Größe von Nanopartikeln ist für die Transfektion wichtig und kleine Nanopartikel sind für die Genabgabe effizienter47,48. Parallel dazu verwendeten Wang et al.49 eine ionische Gelierungsmethode zur Herstellung kleiner (100–200 nm) Chitosan-Nanopartikel für die Genübertragung. In unserer Studie beträgt die durchschnittliche Größe von GINPs jedoch 6 nm bis 40 nm, wobei die höchste Häufigkeit zwischen 7,5 nm und 12,5 nm beobachtet wurde, was für die Transfektion zuverlässiger sein kann.

Zuvor wurde viel über die Verwendung von Nanopartikeln zur Genübertragung in Pflanzen zur Verbesserung der Nutzpflanzen geforscht50,51. Demirer et al. stellten in ihrer Studie ein auf Nanomaterialien basierendes Abgabesystem vor, das eine DNA-Abgabe mit hoher Effizienz und Ungiftigkeit oder Gewebeschädigung und ohne Transgenintegration in Pflanzen ermöglicht52. Tatsächlich kann es die herkömmlichen Genübertragungsmethoden für Pflanzen problemlos ersetzen53. Diese Methode der Genübertragung über GINPs zeigt nicht nur vielversprechende konsistente Ergebnisse und produziert stabile Linien mit höherer Lebensfähigkeit als herkömmliche Genübertragungssysteme, sondern verfügt auch über die Fähigkeit, die Einschränkungen der widerspenstigen Genübertragung verschiedener Pflanzenarten zu überwinden. Unsere neu entwickelte Methode könnte daher problemlos zur sicheren Verbesserung von Nutzpflanzen in sehr kurzer Zeit eingesetzt werden, da sie ungiftig und kostengünstig ist. Dieser Ansatz kann es uns auch ermöglichen, abiotische Einschränkungen der Pflanzen anzugehen und sie letztendlich anpassungsfähiger für den Anbau unter ungünstigen Umweltbedingungen zu machen.

Die durch Nanopartikel vermittelte Genabgabe kann eine wichtige Rolle bei der Etablierung einer neuen und stabilen Plattform für die Gentechnik spielen. In der vorgestellten Studie erwies sich der Magnetofektionsansatz als vielversprechende Methode für die Transformation unter Verwendung von Nanopartikeln als Träger. Diese Studie basiert auf einem kompetenten Magnetofektionsansatz mit geringer Zytotoxizität. Die Eisen-NPs wurden aus C. sinensis mithilfe der grünen Synthese synthetisiert, einem umweltfreundlicheren Ansatz. Diese Methode der Genübertragung über GINPs zeigt nicht nur vielversprechende konsistente Ergebnisse und produziert stabile Linien mit höherer Lebensfähigkeit als herkömmliche Genübertragungssysteme, sondern verfügt auch über die Fähigkeit, die Einschränkungen der widerspenstigen Genübertragung verschiedener Pflanzenarten zu überwinden. Diese Technik kann zur Umwandlung derzeit anfälliger Pflanzensorten in resistentere Sorten mit hohem Ertrag eingesetzt werden, wobei die Herausforderungen des Krankheitserregerbefalls und die daraus resultierenden Ertragsverluste auf kostengünstigere und umweltfreundlichere Weise bewältigt werden können, indem der Einsatz giftiger Pestizide vermieden wird. Darüber hinaus kann es auch zur Überwindung regionaler Zwänge aufgrund abiotischer Beschränkungen eingesetzt werden, die den Anbau wirtschaftlich wichtiger Nutzpflanzen verbieten (Ergänzende Zahlen).

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken der University of the Punjab für die Bereitstellung von Mitteln zur Vervollständigung der Forschungsarbeiten und der Lahore Garrison University für die Unterstützung und Bereitstellung von Laboreinrichtungen.

Abteilung für Biotechnologie, Lahore Garrison University, Postfach. 54000, Lahore, Pakistan

Naila Farooq, Laraib Ather und Qamar Abbas

Abteilung für Gartenbau, Fakultät für Agrarwissenschaften, Universität Punjab, Postfach. 54590, Lahore, Pakistan

Muhammad Shafiq

Virologisches Labor, CABB University of Agriculture, Faisalabad, Pakistan

Muhammad Shah Nawaz-ul-Rehman

Abteilung für Pflanzenpathologie, Fakultät für Agrarwissenschaften, Universität Punjab, Postfach. 54590, Lahore, Pakistan

Muhammad Haseeb, Tehmina Anjum, Mujahid Hussain und Numan Ali

Abteilung für Agronomie, Fakultät für Agrarwissenschaften, Universität des Punjab, Postfach. 54590, Lahore, Pakistan

Syed Agha Armaghan Asad Abbas

Fakultät für Agrarwissenschaften, Universität des Punjab, Postfach. 54590, Lahore, Pakistan

Sehrish Mushtaq und Muhammad Saleem Haider

Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik (IBBB), The Islamia University of Bahawalpur, PO BOX. 63100, Bahawalpur, Pakistan

Saleha Sadiq

North Florida Research and Education Center, 155 Research Rd., Quincy, FL, 32351, USA

Muhammad Adnan Shahid

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An der Datenanalyse waren NF, LA, MS, TA, QA, SAAAA, NA, Muj.H, Muh.H und SM beteiligt. MS und TA lieferten die Gesamtleitung und das experimentelle Design. NF, LA, QA, Muj.H, Muh.H, SAAAA, NA und SM haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Muhammad Shafiq oder Muhammad Adnan Shahid.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Farooq, N., Ather, L., Shafiq, M. et al. Magnetofektionsansatz zur Transformation von Okra mithilfe grüner Eisennanopartikel. Sci Rep 12, 16568 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20569-x

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Eingegangen: 30. Oktober 2021

Angenommen: 15. September 2022

Veröffentlicht: 04. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20569-x

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