Boten-RNA in Lipid-Nanopartikeln rettet HEK 293-Zellen vor Lipiden

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22293 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Analysewerkzeuge zur Untersuchung der Zellphysiologie sind für die Optimierung der Arzneimittel-Wirt-Interaktionen von entscheidender Bedeutung. Echtzeit-Pulse-Chase-NMR-Spektroskopie (RTPC-NMR) wurde eingeführt, um die Kinetik der Metabolitenproduktion in HEK 293T-Zellen zu überwachen, die mit COVID-19-Impfstoff-ähnlichen Lipid-Nanopartikeln (LNPs) mit und ohne mRNA behandelt wurden. Kinetische Flussparameter wurden für den Einbau der Isotopenmarkierung in Metaboliten und die Entfernung markierter Metaboliten aus den Zellen ermittelt. Veränderungen in den charakteristischen Zeiten für die Alaninproduktion führten zu einer mitochondrialen Dysfunktion als Folge der Behandlung der Zellen mit Lipid-Nanopartikeln, LNPs. Die mitochondriale Dysfunktion wurde durch den Einbau von mRNA in die LNPs weitgehend gemindert, deren Vorhandensein die Größe und Einheitlichkeit der LNPs erhöhte. Die Methodik ist auf alle kultivierten Zellen anwendbar.

Der bemerkenswerte Erfolg pseudouridinmodifizierter mRNA-Lipid-Nanopartikel (LNP)-basierter Impfstoffe gegen COVID-19, die sich die angeborene Translationsmaschinerie zunutze machen, die durch den Zellstoffwechsel angetrieben wird, katapultiert diese Technologie an die Spitze der Medizin1,2,3,4,5,6 . Viele potenzielle Anwendungen von mRNA-LNPs zur Behandlung chronischer Krankheiten wie Diabetes7,8,9, Krebs und genetischen Störungen10,11 wurden getestet. Messenger-RNA-basierte Therapeutika nutzen einen komplexen Satz biologischer Moleküle, die für jede Anwendung optimiert werden müssen. Können diese Zellen die umliegenden Zellen um knappe Nährstoffressourcen in lebenden Geweben verdrängen? Wie lange wird die effektive Produktion von mRNA-Genprodukten anhalten? Wird der Abbau von mRNA-LNPs, der Methylpseudouridin freisetzt, die Transkription hemmen? Schädigen die Lipide, aus denen LNPs bestehen, das Plasma und die inneren Zellmembranen? Diese Probleme sind von entscheidender Bedeutung und müssen angegangen werden, um die therapeutische Umsetzung zu erleichtern.

Die dynamische Reaktion von Zellen auf medikamentöse Behandlungen kann durch Stoffwechselprofilierung beurteilt werden, die im Allgemeinen durch Massenspektroskopie oder NMR-Spektroskopie erreicht wird12,13. Die Methodik erfordert in der Regel eine Zelllyse und -extraktion, um die Gesamtkonzentration der Metaboliten zu ermitteln. Dadurch werden Momentaufnahmen der Zellphysiologie über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen bereitgestellt, die aufgrund der mehrstufigen Prozesse, die zur Vorbereitung der Proben erforderlich sind, von Natur aus verzerrt sind12,13. Die invasive Methodik stört die Kompartimentstruktur der Stoffwechselnetzwerke und spiegelt möglicherweise nicht die reaktiven Prozesse wider, die nach der Aufnahme des LNP-basierten Impfstoffs stattfinden. Die Echtzeit-NMR-Spektroskopie verwendet natürliche 13C-Häufigkeits- oder Tracer-basierte Analysen, um Metaboliten zu identifizieren, indem sie 13C-Isotopen-editierte 1H-Spektren von Zellen sammeln, was eine schnelle Datenerfassung ermöglicht und dadurch die zeitliche Auflösung der Experimente auf 10 Minuten oder weniger erhöht14,15.

Neuere Echtzeit-NMR-basierte Metabolomstudien verwenden einen Bioreaktor, um Zellen in einem physiologisch aktiven Zustand zu halten, und können freie intrazelluläre Metaboliten nachweisen, es fehlt jedoch die Möglichkeit, Schlüsselreaktionen wie die Glykolyse zu überwachen, die im Laufe von Minuten stattfinden16,17,18 . Die Einführung der Echtzeit-Pulse-Chase-NMR-Spektroskopie, RTPC-NMR, kombiniert die Verwendung von 13C-Glucose und 13C-editiertem Protonen-NMR mit einer hochempfindlichen NMR-Kryosonde19 und dem verbesserten Design eines Bioreaktors20, um die Zeitauflösung der Experimente auf 47 s zu erhöhen Dies ermöglicht die Verfolgung schneller Veränderungen der Stoffwechselströme als Reaktion auf Reize. 13C-markierte Metaboliten werden vor einem unmarkierten Hintergrund beobachtet. Diese Methode stellt den neuesten Stand der Technik zur Analyse der Zellgesundheit dar, indem sie die Dynamik des 13C-Kohlenstoffeinbaus auf unvoreingenommene Weise erfasst, um aufzudecken, wie Reize Stoffwechselwege beeinflussen.

Modifizierte Luciferase-mRNA, die N1-Methylpseudouridin anstelle von Uridin enthielt, wurde durch In-vitro-Transkription basierend auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll21,22 hergestellt und für alle Experimente verwendet. Der Einbau von N1-Methylpseudouridin erhöht die mRNA-Stabilität und verbessert die Proteinexpression in Säugetierzellen22,23. Das gereinigte Transkript enthielt einen ca. 150 Nukleotide langen 3'-Poly(A)-Schwanz und 5'-Cap124, um die Proteintranslation weiter zu erleichtern (ergänzende Abbildung 1). Die modifizierte mRNA wurde 24 Stunden lang unter Verwendung von fünf Transfektionsreagenzien in HEK 293T-Zellen transfiziert (Abb. 1a, Ergänzungstabelle 1). HEK 293T-Zellen wurden zuvor zur Überwachung der Aufnahme und Expression von Luciferase-mRNA21,22 verwendet. In Übereinstimmung mit Kariko et al.21,22 lieferte nur ein Reagenz, Lipofectamine 2000, LF, ausreichend mRNA in die Zellen, um ein Luciferase-abhängiges Lumineszenzsignal zu erzeugen.

Lipofectamin erhöht die Stabilität der in HEK 293T-Zellen transfizierten mRNA. (A). Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit modifizierter Luciferase-mRNA unter Verwendung von fünf verschiedenen Reagenzien transfiziert und die resultierende Luciferase-Lumineszenzaktivität wurde quantifiziert. Die Kontrolle enthielt keine mRNA und kein Transfektionsreagenz zur Beurteilung der Grundlumineszenz. Balken zeigen den relativen Fehler an. (B). Lumineszenz resultierend aus VECT-Transfektion mit nackter modifizierter Luciferase-mRNA (Quadrate) und LF-vermittelter Transfektion mit modifizierter Luciferase-mRNA (Kreise). (C). Lumineszenz von HEK 293T-Zellen, die über verschiedene Zeiträume mit LF-mRNA behandelt wurden. Die Proben wurden kontinuierlich (durchgezogene Linie, Kreise) oder 8 Stunden lang (gepunktete Linie, Quadrate) oder 12 Stunden lang (gestrichelte Linie, Dreiecke) behandelt.

Die Technik des Volumenaustauschs für konvektiven Transfer (VECT)25,26 wurde verwendet, um HEK 293T-Zellen mit nackter mRNA zu transfizieren. Trotz der chemisch modifizierten Base war die Proteinproduktion begrenzt und das Luciferase-abhängige Signal nahm schnell ab (Abb. 1b, Ergänzungstabelle 2). Die LF-vermittelte Transfektion derselben mRNA führte zu einer anhaltenden Proteinexpression. Die Daten deuten darauf hin, dass selbst modifizierte mRNAs äußerst instabil sind und dass die Verwendung von Transfektionsreagenzien zum Schutz der mRNA vor dem Abbau für eine nachhaltige Proteinexpression von entscheidender Bedeutung ist.

Um ein Analysefenster für Stoffwechselstudien zu erstellen, wurde das Ausmaß der Proteinexpression durch Inkubation von HEK 293 T-Zellen mit LF-mRNA-LNPs für verschiedene Zeiträume untersucht. Kontinuierlich oder 8 oder 12 Stunden lang behandelte Proben erzeugten im gleichen Zeitraum vergleichbare Mengen an Luciferase-abhängiger Aktivität (Abb. 1c, Ergänzungstabelle 3). Die maximale Proteinexpression wurde bei kontinuierlichen und 8-stündigen Transfektionen nach ca. 15 Stunden beobachtet, wohingegen die 12-stündige Transfektion die maximale Proteinexpression nach ca. 20 Stunden aufwies. Alle nachfolgenden Transfektionen wurden 10 Stunden lang inkubiert, um die Proteinproduktion zu maximieren und den experimentellen Komfort zu erhöhen.

Die relative Stabilität und Wirksamkeit von LNPs sind eine Funktion des Partikeldurchmessers und der Dispersität, die die Effizienz der Bioverteilung, der Gewebedurchdringung, der Ladungsbeladung und -freisetzung sowie der Zellaufnahme in Geweben steuern27,28,29. Bei kultivierten Zellen wird erwartet, dass die LNP-Größe eine geringere Rolle bei der Bereitstellung der Ladung spielt, da es keine Kreislauf- und Lymphsysteme gibt, die das Eindringen in das Gewebe durch die schnelle Entfernung kleinerer Partikel minimieren. LNPs bilden polydisperse liposomale Strukturen mit wässrigen Innenräumen, die durch eine Tensiddoppelschicht stabilisiert werden; Der wässrige Kern bietet eine stabile Umgebung für mRNA und reduziert so den vorzeitigen Abbau im Vergleich zu nackter mRNA30,31. Um die Rolle der mRNA bei der Wechselwirkung mit LF zu ermitteln, wurden LNPs mit und ohne mRNA zusammengesetzt und für die elektronenmikroskopische Bildgebung negativ mit Uranylacetat gefärbt (Abb. 2). In Abwesenheit von mRNA war die LNP-Größenverteilung asymmetrisch mit einer mittleren Partikelgröße von 29 ± 12 nm (Abb. 2a und c). Der Einschluss von mRNA-Fracht in LF-LNPs führte zu einer größeren, weniger polydispersen Population von Partikelgrößen mit einem Mittelwert von 135 ± 12 nm (Abb. 2b und d), der im Bereich von 100–200 nm liegt, der erfolgreich eingesetzt wurde Krebsmedikamente an hochpermeable Tumoren verabreichen32.

Die Größe der Lipid-Nanopartikel wird durch mRNA stabilisiert. (a) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Liposomen ohne mRNA. (b) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Liposomen, die Luciferase-mRNA enthalten. (c) Größenverteilung der LNPs ohne mRNA. (d) Größenverteilung der LNPs, die Luciferase-mRNA enthalten. Die Gaußsche Kurve wurde gezeichnet, um die vergleichende Visualisierung der Verteilung zu erleichtern.

Dem zuvor beschriebenen Echtzeit-RT-NMR-Bioreaktor33 wurde eine Pulse-Chase-Fähigkeit hinzugefügt. Der Bioreaktor hält über > 24 Stunden hohe Mengen an phosphathaltigen Metaboliten aufrecht, was mit einer hohen Energieladung und metabolisch aktiven Zellen vereinbar ist33. HEK 293T-Zellen wurden wie zuvor beschrieben in kleine Alginatkügelchen mit einem Durchmesser von ~ 0,6 mm verpackt, indem ein Zerstäuber20 und modifizierter Krebs-Henseleit-KH-Puffer34 verwendet wurden, ein klassisches chemisch definiertes35 serumfreies Medium, das zur Untersuchung von Kardiomyozyten verwendet wird. KH-Puffersalze wurden mit Glucose, Rinderserumalbumin, BSA, Insulin und Palmitinsäure ergänzt. Das entscheidende Merkmal des Bioreaktors ist ein mikroporöser Spülschaft (Abb. 3a), der eine gleichmäßige Verteilung des frischen Mediums über gepackte Zellkügelchen33 im 5-mm-NMR-Röhrchen ermöglicht und einen schnellen Austausch des Mediums aus dem ~ 200 µL NMR-Probenvolumen ermöglicht. Ein 15-ml-Impuls gleichmäßig markierter [U, 13C]-Glucose wurde über eine Injektionsschleife verabreicht, die in einer Linie mit dem Mediumabgabeschlauch angebracht war und durch einen mechanischen Schalter gesteuert wurde (Abb. 3a). Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wurde der Innendurchmesser des Schlauchs an die Öffnungen der Gelenke im gesamten Gerät angepasst. Der Fluss wurde durch eine peristaltische Pumpe gesteuert, um 100–200 µL/min zu liefern. Die Leistung des Geräts wurde optimiert, um einen Impuls markierter Glukose mit einer Anstiegszeit von etwa 10 Minuten einzuführen, die schneller ist als die charakteristische Zeit der Glykolyse von 10–20 Minuten36. Zu diesem Zweck wurde die Versuchstemperatur auf 300 K eingestellt, um den Zellstoffwechsel zu verlangsamen37. Die Optimierungsläufe zeigten, dass 10 Millionen Zellen, die in Alginatkügelchen verpackt und mithilfe eines mikroporösen Spülstabs gefüttert wurden, in der Lage sind, ~ 25 % der im Verlauf des Experiments verabreichten 13C-Glucose zu verbrauchen (ergänzende Abbildung 2).

Echtzeit-Pulse-Chase-NMR-Spektroskopie. (a) Bioreaktor für RT-PC-NMR. Der modifizierte Bioreaktor umfasst eine injizierbare Schleife für Pulse-Chase-Experimente oder ein Ventil für Step-Chase-Experimente. (b) 13C-bearbeitete heteronukleare Einzelquantenkohärenz, 1H-13C HSQC, NMR-Spektrum, das in der Zelle vorhandene Metaboliten zeigt. Die Einschübe zeigen die Aufspaltung von Metaboliten-Kreuzpeaks und Glykogen-Kreuzpeaks. Die Projektion des 2D 1H-13C HSQC in die Protonendimension liegt am oberen Ende des Spektrums. Der Ethanolpeak entsteht, weil Ethanol verwendet wurde, um den Palmitinsäurezusatz im modifizierten KH-Puffer zu solubilisieren. Unbeschriftete Peaks von Metaboliten, die aufgrund eines niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses oder einer Überlappung mit Puffer- oder Glucose-Peaks nach der Projektion auf die 1H-Achse nicht für die Analyse verwendet wurden, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. (c) Normalisierte 13C-Glucose-Pulse, gejagt mit unmarkierter Glucose in nicht transfizierten HEK 293T-Zellen: (I) Vor dem Puls werden den Zellen unmarkierte Glucose in modifiziertem KH-Puffer zugeführt; (II) Während der Einarbeitungsphase wird ein 15-ml-Puls 13C-Glucose durch die Injektionsschleife eingeführt. (III) die 13C-Glucose erreicht eine Plateaukonzentration; (IV) Während der Clearance-Phase wird die 13C-Glucose aus dem System eliminiert. Während aller Phasen werden die einzelnen Metaboliten auf ihrem Weg durch die Stoffwechselwege überwacht. Die roten und schwarzen Spuren repräsentieren biologische Replikatproben. (d) Anstiegs- und Abfallzeiten für die Vorder- und Hinterflanken, tRG und tFG, der in Tafel c gezeigten Impulse.

Der ATP-Spiegel der Zellen wurde vor und nach jedem Experiment durch Aufnahme eines Phosphor-NMR-Spektrums überwacht. Lebende Zellen halten homöostatische ATP-Spiegel aufrecht, die in einem 1D-Spektrum leicht zu erkennen sind. Die Ergebnisse zeigten keine Verringerung des ATP-Spiegels im Verlauf jedes Experiments (ergänzende Abbildung 3). Der intrazelluläre pH-Wert wurde aufgrund der Differenz zwischen Phosphokreatin (PCr) und anorganischem Phosphat (Pi) auf einen Wert zwischen 7,2 und 7,5 geschätzt. Die Peaks liegen bei −3,18 ppm bzw. 2,13 ppm38,39. Die Sauerstoffversorgung wurde anhand des PCr/ATP-Verhältnisses beurteilt und betrug ~ 0,6, was im Bereich liegt, der normalerweise für perfundierte Rattennieren beobachtet wird (ergänzende Abbildung 3)40. Dieses Verhältnis änderte sich im Verlauf des Experiments nicht und zeigte, dass die Zellen trotz der dichten Verpackung in Alginatkügelchen nicht hypoxisch waren41,42.

Eindimensionale 13C-editierte Protonen-NMR-Experimente43 wurden verwendet, um Kohlenstoff zu überwachen, der aus der isotopenmarkierten Glucose43 metabolisiert wurde. Da sich Protonensignale von Metaboliten überlappen, wurde zunächst ein zweidimensionales 13C-editiertes heteronukleares Einzelquantenkohärenz-NMR-Spektrum (HSQC43) aufgenommen, um die im Protonenspektrum vorhandenen Metaboliten zu identifizieren (Abb. 3b). Nur die Peaks von Hγ-Cγ von Glutamat, Hβ-Cβ von Alanin und Hγ-Cγ von Laktat überlappten sich nach der Projektion auf die Protonendimension nicht (Abb. 3b). Die beobachteten Aufspaltungen in der Kohlenstoffdimension zeigten, dass Laktat, Alanin und Glutamat Produkte der Glykolyse und eines einzelnen TCA-Zyklus waren (Einschübe in Abb. 3b)44. Aufgrund der kontinuierlichen Glukosezufuhr war kein signifikanter Beitrag der Glukoneogenese zu erwarten. Die nicht überlappenden Peaks für Laktat, Alanin und Glutamat waren ausreichend stark, um die Erfassungszeit auf 47 s zu verkürzen, was der zeitlichen Auflösung der Experimente entspricht.

Ein Pulsprofil für 13C-Glucose in unbehandelten HEK 293T-Zellen ist in Abb. 3c dargestellt. Es gab einen schnellen Anstieg des Signals, als die isotopenmarkierte Glucose in das NMR-Röhrchen gelangte. Das Signal erreichte eine Plateaukonzentration und nahm ab, als die 13C-Glucose von unmarkierter Glucose verdrängt wurde. Die Nichtidealität der Vorder- und Hinterflanken des Glukosepulses wird durch die Anstiegs- und Abfallzeiten tRG bzw. tFG beschrieben, die durch Anpassen des Puls-Verfolgungsprofils an eine einphasige exponentielle Assoziation/einen exponentiellen Abfall aufgelöst wurden (ergänzende Abbildung). 4 und Ergänzungstabelle 4). Beim Eintritt und Austritt des Impulses in das System treten unterschiedliche Diffusionsraten auf, was zu deutlich längeren Abfallzeiten führt (ergänzende Abbildung 5). Diese Unterschiede sind teilweise auf die Variation der Zellpackungsdichte zurückzuführen, die mit jeder physischen Probe verbunden ist.

HEK 293T-Zellen wurden in OptiMEM auf Platten gezüchtet und entweder unbehandelt gelassen (Kontrolle) oder über Nacht mit LF oder LF-mRNA behandelt. Das Schicksal von Laktat, Alanin und Glutamat wurde während der Metabolisierung der markierten Glukose überwacht (Abb. 4). Jedes Experiment dauerte etwa 6 Stunden und wurde mindestens zweimal unter Verwendung biologischer Replikate wiederholt. Im Gegensatz zu markierter Glucose variierten die maximalen Kreuzpeakintensitäten der Metaboliten zwischen den einzelnen Experimenten um den Faktor zwei, während das Zeitprofil unverändert blieb. Die Variation in der absoluten Konzentration von Metaboliten bei jeder Zellpräparation spiegelt die inhärente (klonale) Heterogenität lebender Zellen wider, die auch ohne Veränderungen im Wachstum vorhanden ist, und ist für biologische Replikatproben nicht unerwartet45,46. Die Metaboliten-Kreuzpeakintensitäten nahmen zu, wenn markierte Metaboliten nach der Biosynthese in den freien Pool gelangten, und verringerten sich, wenn sie vorübergehend gebunden oder in größere Biomoleküle eingebaut wurden, oder aus dem freien Pool entfernt wurden, wenn markierte Glucose aus dem System entfernt wurde.

Skalierte kinetische Flussprofile von Metaboliten in HEK 293T-Zellen. (a) Abbildung, die die metabolische Disposition von 13C-Glucose zeigt, die während eines RTPC-NMR-Experiments beobachtet wurde. (b) Kinetische Flussprofile von Metaboliten, die aus einem 15-ml-13C-Glucose-Puls in HEK 293T-Zellen und einer kontinuierlichen Zufuhr von 13C-Glucose in HEK 293T-Zellen resultieren, die 10 Stunden lang mit LF behandelt wurden. Die roten und schwarzen Spuren repräsentieren biologische Replikatproben.

Unter Bedingungen eines gleichmäßigen Nährstoffflusses zeigte die Vorder-/Hinterkante der Pulse-Chase-Profile einen exponentiellen Anstieg/Abfall der Konzentration freier Metaboliten. Um kinetische Parameter für die Produktion einzelner markierter Metaboliten abzuschätzen, wurden KFPs aus zwei Experimenten skaliert und die Vorderkanten an eine zweiphasige Exponentialfunktion angepasst, die die tatsächliche Form des 13C-Glucose-Pulses berücksichtigt:

Dabei ist y die relative Konzentration des freien Metaboliten, tP die Produktionszeiten, die erforderlich sind, damit die Metabolitensignale eine Sättigung von ~ 63 % erreichen, yPo ist die relative Konzentration, wenn das Signal zu steigen beginnt, und ARo und AP sind Konstanten. Um die kinetischen Parameter für die Clearance markierter Metaboliten aus dem freien Pool abzuschätzen, wurden die Hinterkanten der Profile auch an eine Zweiphasen-Exponentialfunktion angepasst:

Dabei ist tC die Clearance-Zeit für eine 63-prozentige Reduzierung der Metabolitensignale, yCo die relative Konzentration, wenn das Signal abzunehmen beginnt, und AFo und AC Konstanten. Der erste Term in Gl. (1) und (2) berücksichtigen die Nichtidealität der 13C-Glukoseimpulse aufgrund der Diffusion (Abb. 3c und d und Ergänzungstabelle 4), wenn tRG und tFG nicht viel kürzer als tP und tC der Metaboliten sind.

Kontroll-HEK 293T-Zellen, die keiner LF- oder LF-mRNA-Behandlung unterzogen wurden, zeigten klar definierte Vorder- und Hinterkantenprofile für Laktat, Alanin und Glutamat (Abb. 4). Der Laktatspiegel erreichte einen isotopischen Steady-State47, der anhielt, bis die markierte Glukose verjagt wurde. Alanin zeigte unter Kontrollbedingungen einen leichten, stetigen Rückgang der Plateauwerte. Das Profil für Glutamat erreichte ungefähr zu der Zeit ein Maximum, als der markierte Glukoseimpuls aus dem System verjagt wurde.

Die für die Produktion (tP) und die Clearance (tC) aufgelösten durchschnittlichen Zeitkonstanten betrugen 14 bzw. 26 Minuten für Laktat und 13 bzw. 30 Minuten für Alanin (Ergänzungstabelle 5 und ergänzende Abbildungen 6 und 7), was mit der Tatsache übereinstimmt, dass Laktat, das aus Pyruvat gewonnen wird, und Alanin sind Produkte der Glykolyse, dem schnellsten Stoffwechselweg, der im Zytosol vorkommt (Abb. 4). Glutamat, das in Mitochondrien aus α-Ketoglutarat während des TCA-Zyklus synthetisiert wird, wies aufgrund seiner Abhängigkeit von den Produkten der Glykolyse und des langsamen Imports und Exports von Metaboliten von und nach die langsamsten durchschnittlichen Zeiten (75 und 60 Minuten) für Produktion und Clearance auf Mitochondrien (Ergänzungstabelle 5 und Ergänzungsabbildung 8).

Die kinetischen Flussprofile von Laktat und Alanin in mit LF oder LF-mRNA behandelten Zellen ähnelten qualitativ den Kontrollen (Abb. 4) und zeigten aufgrund der gebundenen Fraktion des markierten Metaboliten einen kleinen, aber signifikanten Anstieg von tC im Vergleich zu tP (Ergänzungstabelle 5). oder deren Vorläufer (Ergänzungstabelle 5, Abb. 5a). Die anhaltend langsamere Clearance-Zeit für Laktat und Alanin spiegelte einen Anstieg der Konzentration frei markierter Metaboliten wider, da diese aus der gebundenen Fraktion ausgetauscht und für den laufenden Stoffwechsel genutzt wurden. Die Unterschiede zwischen tP und tC für Glutamat waren nicht signifikant (Ergänzungstabelle 5, Abb. 5a), höchstwahrscheinlich, weil die freie intrazelluläre Konzentration von Glutamat typischerweise etwa 20-mal höher ist als die von Laktat oder Alanin48, so dass gebundenes markiertes Glutamat die Konzentration nicht wesentlich verändert freie Konzentration. Die deutlichste Abweichung wurde für Alanin in LF-exponierten Zellen beobachtet (Abb. 4), bei denen das in Kontrollzellen beobachtete Isotopen-Steady-State-Plateau durch einen monotonen Abfall der Signalstärke ersetzt wurde, gefolgt von einem schnellen exponentiellen Abfall, wenn der markierte Glukoseimpuls vorhanden war ENTFERNT. Die Isotopen-Steady-State-Alaninspiegel wurden wiederhergestellt, wenn die Zellen mit LF-mRNA behandelt wurden.

Statistische Auswertung der Unterschiede zwischen den KFP-Parametern (a) Produktions- und Freigabezeiten, tP und tC; (b) charakteristische Zeiten, tch = 2/(1/tP + 1/tC), (c) Bindungsparameter, K = (1/tP – 1/tC)/2, für jeden Metaboliten und (d) die Steigungen von Alanin-KFPs nach Behandlung mit LF und LF-mRNA. Punkte stellen Datenpunkte dar, die mit biologischen Replikatproben gewonnen wurden. Sterne zeigen Signifikanz an: p < .05 (*), p < .01 (**) und p < .001 (***).

Es ist zu beachten, dass Laktat auch im Durchfluss des Bioreaktors nachgewiesen wurde und daher aus den Zellen ausgeschieden wird (ergänzende Abbildung 2), aber die Ausscheidungsrate beträgt ~ 1/20 min−1, was der Rate der Laktatproduktion entspricht (Tabelle 1). ist viel langsamer als die Nährstoffflussrate von 200 µL/min geteilt durch das 200 µL NMR-Probenahmevolumen (1 min−1). Infolgedessen wird überwiegend intrazellulär markiertes Laktat beobachtet. Die Zeiten der Laktat- und Alaninproduktion, tP, waren in LF-mRNA-behandelten HEK 293-T-Zellen im Vergleich zur Kontrolle signifikant langsamer (Abb. 5a; Ergänzungstabelle 5). Glutamatprofile zeigten durchweg höhere experimentelle Fehler in mit LF oder LF-mRNA behandelten Zellen. Dies könnte auf das bei biologischen Replikaten inhärente Probenahmerauschen oder auf eine fehlerhafte mitochondriale Aktivität oder beides zurückzuführen sein.

Der Isotopen-Steady-State-Einbau von Metaboliten in die gebundene Fraktion und die Akkumulation freier Metaboliten unter allen Bedingungen können durch ein einfaches Modell der Konkurrenz um Bindungsstellen erklärt werden (siehe Gleichungen (14) und (15)). Das Modell sagt voraus, dass die Konkurrenz zwischen markierten und unmarkierten Metaboliten um Bindungsstellen tP verkürzen und tC verlängern wird (Gleichungen 11 und 13, Ergänzungstabelle 5, Ergänzungsabbildung 9). In diesem Modell ist die charakteristische Zeit des Metabolitenflusses, tch, gleich dem harmonischen Mittel zwischen tP und tC und der charakteristische Bindungsparameter, der die Zeit für den Einbau der markierten Glucose in und die Freisetzung aus der gebundenen Fraktion, K, beschreibt, ist gleich auf die Hälfte der Differenz zwischen 1/tP und 1/tC und entspricht der Einschaltrate multipliziert mit der Konzentration der Bindungsstellen (Tabelle 1).

Für den Laktat- und Glutamatstoffwechsel nach der Behandlung mit LF oder LF-mRNA oder für mit LF behandeltes Alanin wurden keine signifikanten Unterschiede im tch festgestellt (Tabelle 1, Abb. 5), was darauf hindeutet, dass die glykolytischen und mitochondrialen Stoffwechselflüsse ungestört waren. In Gegenwart von LF-mRNA kam es im Vergleich zu Kontrollzellen zu einem signifikanten Anstieg des tch für den Alaninstoffwechsel (Abb. 5b). Der Anstieg weist auf eine Veränderung des Alaninstoffwechsels in mit LF-mRNA behandelten Zellen hin, was zu einer längeren Nutzungszeit des freien Alaninpools führen könnte, was zu einer höheren gebundenen Fraktion und/oder einer Verringerung der Alaninproduktion führen könnte. Die für jeden Metaboliten aufgelösten K-Werte unterschieden sich jedoch nicht signifikant, was bedeutet, dass die metabolische Verteilung von gebundenen und freien Metaboliten durch das Vorhandensein von LF oder LF-mRNA nicht beeinflusst wurde (Abb. 5c; Tabelle 1). Die für Glutamat aufgelösten negativen Werte resultierten aus dem großen Fehler, der mit diesen Messungen verbunden war.

Um die mit dem Alaninstoffwechsel verbundenen Störungen weiter zu untersuchen, wurde eine Stufenfunktion von markierter Glucose auf Zellen angewendet, die 10 Stunden lang mit LF behandelt wurden (Abb. 4). Die Injektionsschleife wurde durch ein Ventil ersetzt, das den Einlassfluss auf ein Reservoir mit 13C-Glucose-Medium umschaltete. Laktat und Glutamat zeigten ein isotopisches Steady-State-Verhalten, aber das Profil für Alanin erreichte einen Maximalwert und nahm im Verlauf des Experiments, das etwa doppelt so lange dauerte wie die Pulsexperimente, monoton ab. Die Abnahme der Plateausignalintensität für Alanin wurde analysiert, indem die Alaninplateauprofile an eine lineare Funktion angepasst wurden (Ergänzungstabelle 6; Abb. 5d). Der durchschnittliche Wert der aufgelösten Steigung für mit LF behandelte Zellen, 0,005 min-1, war tendenziell 2,5-mal größer als bei der Kontrolle und signifikant 5-mal größer als bei mit LF-mRNA behandelten Zellen (Ergänzungstabelle 6), was auf einen sehr langsamen Prozess hinweist (Abb. 5d). Da die Verteilung von gebundenem und freiem Alanin ungestört war und die geringe Menge an ausgeschiedenem Alanin während des Experiments konstant blieb (ergänzende Abbildung 10), spiegelt die Steigung des Alaninplateaus höchstwahrscheinlich eine Abnahme der Alaninbiosynthese wider. Der Großteil der Alaninsynthese hängt von der Verfügbarkeit von Glutamat ab, das aus α-Ketoglutarat, einem Produkt des TCA-Zyklus in Mitochondrien, bei der Biosynthese von Alanin durch Amidierung von Pyruvat entsteht und auf einen mangelhaften Transport von Glutamat aus den Mitochondrien hindeuten kann (Abb . 4a). Es ist auch möglich, dass der Alaninspiegel durch eine Neuverdrahtung des Glutaminstoffwechsels in defekten Mitochondrien beeinflusst wird49, und wenn Mitochondrien durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, ROS, beeinträchtigt werden, kann auch die Produktion von Glutamat beeinträchtigt sein. Beide Zustände könnten zu einer Verkürzung der Zeit der Alanin-Biosynthese führen.

Bei neuronalen Vorläuferzellen, die mit Lipofectamin behandelt wurden, wurden Störungen der Mitochondrienfunktion, Membrandepolarisation und Versagen des Elektronentransports beobachtet50. Das Austreten von Elektronen aus dem Elektronentransportsystem auf der Innenmembran führt zu einer teilweisen Reduktion von Sauerstoff unter Bildung von Superoxid, einem ROS, was letztendlich zur Mitophagie führen kann. Um zu untersuchen, ob die Mitochondrienfunktion durch LF beeinträchtigt werden könnte, wurden HEK 293T-Zellen mit MitoSOX behandelt, das bei Oxidation durch mitochondriale ROS fluoresziert, abgebildet (Abb. 6a) und untersucht (Abb. 6b).

ROS-Produktion in HEK 293T-Zellen als Reaktion auf LNP-Exposition mit und ohne mRNA. (a) MitoSOX-gefärbte Zellen zeigen das Vorhandensein von ROS (rot gefärbt). Die tiefrote FM-Färbung (grün gefärbt) zeigt intakte Mitochondrien. Overlay-Panels weisen darauf hin, dass ROS aus Mitochondrien stammen. (b) Quantifizierung der MitoSOX-Fluoreszenz in Zellen. Punkte stellen Datenpunkte dar, die mithilfe technischer Replikatproben ermittelt wurden. Fehlerbalken stellen die mittlere Abweichung dar. Sterne zeigen Signifikanz an: p < .05 (*), p < .01 (**) und p < .001 (***).

Die Behandlung der Zellen mit einer positiven Kontrolle für ROS, Antimycin A, das an das aktive Qi-Zentrum der Cytochrom-C-Reduktase bindet und die Zellatmung hemmt, führte zu einem signifikanten Anstieg der mitochondrialen ROS im Vergleich zu unbehandelten Zellen (Abb. 6b)51. Mit LF behandelte und 4 Stunden lang inkubierte Zellen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant höhere ROS-Werte auf, und dieser Unterschied nahm mit längeren Inkubationen von 28 Stunden zu. Der Einschluss von mRNA in das LNP führte zu deutlich niedrigeren ROS-Werten im Vergleich zu LF allein, ähnlich wie bei unbehandelten Zellen nach einer 4-stündigen Inkubation (Abb. 6b) und stellte das Isotopen-Steady-State-Plateau für Alanin in der RTPC-NMR-Metabolomik in der Zelle wieder her Experimente (Abb. 4). Die Färbung intakter Mitochondrien und dsDNA zeigte keine Unterschiede bei mitophagischen oder autophagischen Reaktionen (Abb. 6a). Daher könnte die offensichtliche Abnahme der Alanin-Biosynthese auf eine LF-induzierte mitochondriale Dysfunktion zurückzuführen sein, die zu ROS führt.

Da LNP-vermittelte mRNA-Impfstoffe zunehmend als therapeutische Behandlung verfügbar werden, wird das Verständnis der Wirkung von LNPs auf Zellen und Gewebe immer wichtiger5. Messenger-RNAs allein sind zu instabil, um als Transfiziermittel verwendet zu werden, selbst wenn sie modifizierte Basen enthalten. mRNA muss durch spezifische LNPs geschützt werden, damit sie von der Zelle effektiv genutzt werden kann. Aber LNPs sind giftig50. Der Lipidanteil des Impfstoffanalogs schien eine Funktionsstörung der Mitochondrienmembran in Form eines erhöhten ROS hervorzurufen, dessen Auswirkungen durch den Einbau von mRNA in die LNPs gemildert wurden. HEK 293T-Zellen, die mit mRNA-haltigen LNPs behandelt wurden, waren in der Lage, mehr als 24 Stunden lang auf Nährstoffe zuzugreifen und Protein zu produzieren, was darauf hindeutet, dass die unvermeidliche Freisetzung von Pseudouridin beim mRNA-Abbau die Transkription des mRNA-Produkts nicht hemmte. Die Technik reagiert empfindlich auf freie Metaboliten, enthält jedoch Informationen über den kovalent (wie bei Glykogen52) oder nichtkovalent (wie bei Protein-Ligand-Wechselwirkungen53) gebundenen Metabolitenpool. Der Einsatz der In-Cell-Metabolomik als neue Technologie zur Bewertung der schädlichen Auswirkungen von LNPs kann dazu beitragen, deren Wirksamkeit zu optimieren und möglichen Off-Target-Effekten entgegenzuwirken54.

Die meisten Stoffwechselmethoden liefern eine Momentaufnahme der Zellphysiologie, die die Verteilung zwischen freien und gebundenen Metaboliten verändert, indem sie die intrazelluläre Verteilung stört und den Stoffwechselpool verdünnt36. Echtzeit-Pulse-Chase-NMR vermeidet diese Komplikationen, indem ein Puls isotopenmarkierter 13C-Glucose in Zellen innerhalb eines Bioreaktors eingeführt und die Zeiten des Einbaus und der Clearance markierter Metaboliten in lebenden Zellen direkt überwacht werden. Durch den Einsatz eindimensionaler 13C-editierter Protonen-NMR-Pulssequenzen werden nur markierte Verbindungen beobachtet. Die NMR-Signalstärke nimmt zu, wenn 13C-Glucose eingeführt wird, da intrazelluläre Mengen an freien markierten Metaboliten erzeugt werden, und nimmt ab, wenn diese in den Zwischenstoffwechsel eingebaut, vorübergehend gebunden oder aus dem System entfernt werden, wenn der Impuls entfernt wird. Die kurze spektrale Aufnahmezeit ermöglicht eine zeitliche Auflösung von 47 s, schnell genug, um den Beginn schneller Prozesse wie der Glykolyse zu beobachten.

Die RTPC-NMR-Spektroskopie erwies sich als wirksam bei der Überwachung der Aktivität der Energieproduktionswege in HEK 293T-Zellen unter Bedingungen eines isotopischen stationären Nährstoffflusses als Reaktion auf ein mRNA-LNP-Impfstoffanalogon und bei der Identifizierung von Veränderungen im Stoffwechselfluss aufgrund der Einführung von therapeutische Verbindungen. Drei Spezies wurden in den mit Protonen 13C bearbeiteten NMR-Spektren gut aufgelöst: Lactat, Alanin und Glutamat; Diese gehören zu den am häufigsten vorkommenden Metaboliten in einer Zelle48. Der Aufbau von Metaboliten folgte einem gut verstandenen Verlauf von Stoffwechselwegen, die an der Gewinnung zellulärer Energie beteiligt sind. Die jeweils erzeugten kinetischen Profile wurden mithilfe einer Kinetik erster Ordnung analysiert, um Zeitkonstanten tP und tC für die Produktion bzw. Clearance markierter Metaboliten aus Zellen zu ermitteln. Die experimentell abgeleiteten Parameter lösten charakteristische Zeiten für Stoffwechselflüsse, tch, sowie den Beitrag der gebundenen Fraktion von Metaboliten zum Fluss, K, auf. Laktat und Alanin wurden am schnellsten durch Glykolyse produziert, die im Zytosol stattfindet und sofort darauf reagiert das Vorhandensein von Glukose. Die Glutamatsynthese in Mitochondrien, die auf den Produkten der Glykolyse und des TCA-Zyklus beruht, verlief langsamer (Tabelle 1).

Die unter Kontrollbedingungen beobachtete schnelle Anreicherung von Laktat und Alanin wurde durch die Zugabe von LNPs mit oder ohne mRNA größtenteils nicht gestört. Durchweg langsamere Clearance-Zeiten resultierten aus dem Einbau frei markierter Metaboliten oder ihrer Vorläufer in die gebundene Fraktion, die langsam freigesetzt wurde, als der Impuls aus den Zellen verjagt wurde. Der signifikante Anstieg der charakteristischen Zeit für Alanin in mit LF-mRNA behandelten Zellen ist ein Hinweis auf die zuvor beschriebene metabolische Belastung durch die Produktion rekombinanter Proteine, die zu einem langsameren Zellwachstum55 und einer Abnahme der aeroben Glykolyse56,57 führt. Deutliche Veränderungen im Plateauprofil der Alanin-Clearance führten zu einer mitochondrialen Dysfunktion beim Glutamat-Export als Folge der Behandlung der Zellen nur mit LNPs, während die Glutamatproduktion über den TCA-Zyklus ungestört blieb. Dieses Postulat wurde durch das Vorhandensein von ROS in mit LNPs behandelten Zellen gestützt. Durch die Einbeziehung von mRNA in die LNPs wurde das Ausmaß der ROS deutlich verringert und das Kontrollverhalten weitgehend wiederhergestellt. Die Ergebnisse legen nahe, dass Alanin als empfindliche Sonde für LNP-induzierte Toxizität fungieren könnte.

Es wurde gezeigt, dass der Einbau von mRNA in LNPs für eine starke Genexpression notwendig ist. Die Einkapselung von mRNA erhöhte die durchschnittliche Größe der LNPs von 29 auf 135 nm und führte zu einer symmetrischeren Dispersität, Parameter, die für Stabilität und Wirksamkeit entscheidend sind. In dieser Arbeit wurde das Protokoll des Herstellers zur Herstellung von LNPs mit und ohne mRNA verwendet. Es wurde kein Versuch unternommen, die Größenverteilung der resultierenden Partikel zu variieren.

Die internalisierten LNPs diffundieren durch das Zellmedium mit einer Geschwindigkeit, die umgekehrt proportional zu ihrer Größe ist. Wir spekulieren, dass die schnelle Diffusion kleinerer LNPs in Verbindung mit der erhöhten Stabilität, die durch das Fehlen von Lipid-RNA-Wechselwirkungen58 entsteht, zu langlebigen, tiefer eindringenden LNPs führen wird, wo sie mit inneren Membranstrukturen, einschließlich Mitochondrien, interagieren und diese schädigen können. Dies könnte erklären, warum leere LNPs eine größere ROS-Produktion hervorrufen als solche, die mit Ladung beladen sind, und in Kombination mit der Anforderung eines ordnungsgemäßen mitochondrialen Glutamatexports bei der primären Biosynthese von Alanin, warum sich nur die Alaninprofile in Abwesenheit und Anwesenheit von mRNA unterschieden .

Menschliche embryonale Nierenzellen, HEK293T, wurden von der American Type Culture Collection erworben und gemäß den empfohlenen Bedingungen kultiviert. N1-Methylpseudouridintriphosphat wurde von TriLink Biotechnologies bezogen. Die Transfektionsreagenzien Fugene 6, Fugene HD, ViaFect und das Luciferase Assay System Kit wurden von Promega bezogen. Lineares PEI (25 kDa) wurde von Polysciences, Rotenon von MP Biomedicals und Antimycin A von Sigma-Aldrich bezogen. Lipofectamine 2000, LF, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, DMEM, Opti-MEM-reduziertes Serummedium, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS und MitoSOX stammten von ThermoFisher Scientific. Das für die In-vitro-Transkription von Glühwürmchen-Luciferase-mRNA verwendete Plasmid pTK305 wurde von Addgene erworben (Plasmid Nr. 66.812; http://n2t.net/addgene:66812; RRID:Addgene_66812).

Plasmid pTK305 wurde mit dem Restriktionsenzym AscI (New England Biolabs) amplifiziert und linearisiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol/Ammoniumacetat präzipitiert. Linearisierte DNA wurde in RNAse-freiem Tris-EDTA, TE, Puffer bei einer Konzentration von 1 mg/ml erneut aufgelöst und diente als Matrize für die In-vitro-Transkription unter Verwendung des MEGAscript T7 Transcription Kit (Ambion) mit unmodifizierten Nukleotiden oder mit N1- Methylpseudouridintriphosphat ersetzt Uridintriphosphat in der Reaktion. Die mRNA-Synthese wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die resultierende mRNA wurde durch Fällung mit 7,5 M Lithiumchlorid, 50 mM EDTA, LiCl/EDTA für ≥ 30 Minuten bei –20 °C gereinigt. Das Pellet wurde in RNAse-freiem Wasser gelöst.

Um die Cap1-Struktur am 5'-Ende einzuführen, wurde mRNA 10 Minuten lang bei 65 °C denaturiert und das ScriptCap™ Cap1 Capping System (Cellscript) gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines halben Volumens LiCl/EDTA-Lösung beendet und in RNAse-freiem Wasser erneut aufgelöst. Um einen 3'-Poly(A)-Schwanz hinzuzufügen, wurde die mRNA erneut 10 Minuten lang bei 65 °C denaturiert und das A-Plus™ Poly(A) Polymerase Tailing Kit (Cellscript) gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und durch Zugabe von EDTA auf 15 mM beendet. Die mRNA wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens 5 M Ammoniumacetat, Inkubation auf Eis und Zentrifugieren des Niederschlags gereinigt. Die resultierende polyadenylierte, verkappte N1-Methylpseudouridin-mRNA wurde in RNAse-freiem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst, aliquotiert und bei –70 °C gelagert.

HEK 293T-Zellen wurden in Vollmedium, Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, DMEM, ergänzt mit 4 mM L-Glutamin, 5,5 mM D-Glucose, 1 mM Natriumpyruvat, 10 % fötalem Rinderserum (HyClone), 100 Einheiten/ml Penicillin und … gezüchtet 100 mg/ml Streptomycin. Um die Transfektionseffizienz zu bestimmen, wurden die Zellen mit fünf verschiedenen Reagenzien in einer 24-Well-Platte transfiziert, 2 Wells für jede Transfektion. Jede Vertiefung wurde 24 Stunden vor der Transfektion mit 5 × 104 Zellen in 0,5 ml DMEM/10 % FBS ausgesät und in einer Wachstumskammer in 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Das Wachstumsmedium wurde auf Opti-MEM/5 % FBS umgestellt und 0,5 µg Luciferase-mRNA wurden entweder mit 1,5 µL FuGENE 6, 1,5 µL FuGENE HD, 2 µL ViaFect oder 1 µL LF in Opti-MEM kombiniert und inkubiert bei Raumtemperatur gemäß den Empfehlungen des Herstellers. 2,5 µL von 1 mg/ml linearem Polyethylenimin, PEI, wurden mit 0,5 µg Luciferase-mRNA in 47 µL Opti-MEM kombiniert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als autolumineszierende Kontrolle wurden unbehandelte HEK 293T-Zellen verwendet. Transfektionsmischungen wurden auf Wellplatten übertragen und 24 Stunden lang in einer Wachstumskammer inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch Zugabe von 50 µL 1X Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega) lysiert. Die Zellen wurden abgekratzt und der Inhalt der Vertiefung 5 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen überführt und bei –70 °C gelagert. Um die Luciferase-Aktivität zu testen, wurden 20 µL Lysat mit 100 µL Luciferase-Assay-Reagenz (Promega) in einer weißen 96-Well-Platte (Greiner Bio-One) gemischt und sofort auf einem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode-Plattenlesegerät (BioTek Instruments) abgelesen. . Beachten Sie, dass das in diesen Experimenten verwendete LF-Reagenz aus einer Mischung aus polykationischen und Phospholipiden besteht. Die Bildung von LNPs, die Nukleinsäurefracht enthalten, erfolgt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem Phosphatrückgrat des Nukleinsäurepolymers und den positiv geladenen Lipiden59.

Für Zeitverlaufsexperimente wurden transfizierte Zellen auf 10-cm-Platten bis zu einer Konfluenz von 60–80 % gezüchtet und mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco) 5–10 Minuten lang bei 37 °C geerntet. Trypsin wurde durch eine fünffache Verdünnung mit Vollmedium neutralisiert, die Zellen wurden gezählt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 200 g pelletiert. Die Zellen wurden in Opti-MEM/5 % FBS bei einer Konzentration von 0,6–1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml pro Röhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden in der Wachstumskammer in einer abgewinkelten Position mit geöffneten Deckeln inkubiert. Für jede Transfektion wurden 2 µL LF mit 23 µL Opti-MEM gemischt und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Ein µg mRNA in 25 µL Opti-MEM wurde zugegeben und die Inkubation 20 Minuten lang fortgesetzt. Die Transfektionsmischungen wurden zu den Zellen gegeben und Röhrchen in die Wachstumskammer gestellt. Zu geeigneten Zeitpunkten wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, mit PBS gewaschen und wie oben für den Lumineszenztest beschrieben lysiert. Bei einigen Experimenten wurde das Medium nach 8 oder 12 Stunden Transfektion entfernt und zur weiteren Inkubation durch DMEM ersetzt. Wenn Mikrofluidik für die mRNA-Abgabe verwendet wurde (unten), wurden die verarbeiteten Zellen in Opti-MEM/5 % FBS resuspendiert, in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml pro Röhrchen gegeben, in der Wachstumskammer für bestimmte Zeiten inkubiert, zentrifugiert und lysiert über.

Zellen für NMR-Experimente wurden auf 15-cm-Platten in 20 ml DMEM/10 % FBS bis zu einer Konfluenz von 60–80 % gezüchtet. Transfektionsmischungen wurden um das 100-fache vergrößert, d. h. 200 µL LF in 2,5 ml Opti-MEM mit oder ohne 100 µg mRNA. Nach einer 20-minütigen Inkubation wurden Transfektionsmischungen zu den Platten gegeben und die Transfektionen 10–11 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in der Wachstumskammer ablaufen gelassen.

Drei 15-cm-Kulturschalen (Corning), die Kulturmedium enthielten, wurden mit 4 × 106 HEK 293T-Zellen ausgesät und in 5 % CO2 bei 37 °C für 48–72 Stunden bis zu einer Konfluenz von ~ 80 % (~ 1,2 × 107 Zellen/Platte) inkubiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben geerntet60, durch einen 40-µm-Filter geleitet, um Verklumpung und Aggregation zu reduzieren, und gezählt. ~ 3 × 107 Zellen wurden in Zellflusspuffer, 0,4 % BSA, 0,04 % EDTA, 20 % Percoll und 5 µL Tween-20 suspendiert, zu dem modifizierte Firefly-Luciferase-mRNA in Lagerpuffer bis zu einer Endkonzentration von 300 µM hinzugefügt wurde Volumen von 3 ml. Ein Zweikanal-Polydimethylsiloxan-PDMS-Gerät (Volume Exchange for Convective Transfer, VECT) mit starren 9,6-µm-Mikrokanälen wurde wie zuvor beschrieben hergestellt61,62. Das Gerät wurde mit Passivierungspuffer, 1 % BSA in PBS, gespült, um Luft und Ablagerungen zu entfernen, und zur Zyklusüberwachung im Falle von Blasen oder Verstopfungen auf den Tisch eines Vista Vision (VWR)-Mikroskops gestellt. Die Zellsuspension wurde mit einer Spritzenpumpe Modell 300 von New Era Pump Systems mit einer Durchflussrate von 100 µL/min durch das VECT-Gerät geleitet. Der resultierende Durchfluss wurde gesammelt und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert, um die Transfektion zu maximieren und die Zellwiederherstellung zu erleichtern. Die Zellen wurden 6 Minuten lang bei 25 °C und 200 g zentrifugiert und zur In-Zell-NMR-Spektroskopie zweimal mit 5 ml PBS gewaschen.

Kohlenstoffbeschichtete Kupfermikroskopiegitter (300 Mesh, Electron Microscopy Sciences) wurden 30 s lang mit Luft in einem Harrick-Plasmareiniger glimmentladen. Liposomen und Liposom-mRNA-Komplexe wurden in 5-µL-Tröpfchen auf das frisch entladene Gitter aufgetragen und 5 Minuten lang in einer geschlossenen 15-cm-Gewebeschale adsorbieren gelassen, um Lufteinwirkung und Übertrocknung zu minimieren. Die Probenlösung wurde viermal erneut aufgetragen. 2 % (Gew./Vol.) Uranylacetat wurden hergestellt und über Nacht in einem dunklen Raum auf einem Plattformnutator gemischt. Das Gitter wurde 1 Minute lang mit 5 µL 2 % Uranylacetat gefärbt, direkt auf dem Gitter aufgetragen und dreimal mit 5 µL hochreinem destilliertem Wasser gewaschen. Überschüssige Lösung wurde durch Abtupfen mit Whatman-Papier zwischen den einzelnen Schritten entfernt63.

Die mikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem JEOL JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) mit einer Leistung von 80 kV und einer XR401 Charge Coupled Device (CCD)-Kamera (AMT Imaging) aufgenommen. Die Bilder wurden mit einer Belichtungszeit von 780 ms bei Vergrößerungen von 30.000, 40.000 und 80.000 aufgenommen. Insgesamt 17 Bilder mit 1094 Partikeln wurden mit dem Programm Fiji (ImageJ-Software) bei niedrigem, mittlerem und hohem Schwellenwert verarbeitet. Einzelne Partikelbereiche wurden mit der Funktion „Partikel analysieren“ gemessen. Alle Partikel wurden automatisch ausgewählt und manuell überprüft, um Ausreißer wie Partikel direkt am Bildrand oder mehrere Partikel, die sich überlappten, auszuschließen.

~ 10 × 107 Zellen (~ 500 µL) wurden 1:1 (v/v) mit Krebs-Henseleit, KH, Salzen, 50 mM HEPES, pH 7,2, 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM gemischt MgCl2 und 3 mM NaH2PO4 mit 2 % Alginat (Sigma). Die Mischung wurde in eine 3-ml-Spritze überführt und mit einer Luer-Lock-Spitze ausgestattet, die mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel an einen 40 mm langen Tygon-Schlauch (ID 0,79 mm) angeschlossen war. Die Nadel war im 45°-Winkel zur Oberfläche eines 25-ml-Becherglases mit 150 mM CaCl2 ausgerichtet. Die Zellen wurden mit einer Spritzenpumpe (New Era Pump System NE-300) mit 300 µL/min in einen Zerstäuber injiziert. Der Zerstäuber bestand aus einer vertikal ausgerichteten Pipette mit einem Luftstrom von 5,5 l/min. Der Kontakt mit der CaCl2-Lösung führte dazu, dass das Alginat zu gleichmäßig großen Kügelchen polymerisierte, die die Zellen einkapselten. Die CaCl2-Lösung wurde dekantiert und durch 25 ml KH-Salze, ergänzt mit 5 mM Glucose, 0,4 mM Palmitat, 0,4 mM BSA und 70 mU/L Insulin, ersetzt. Anschließend wurden die Perlen in den Bioreaktor überführt.

Der zur Erfassung der Stoffwechseldaten verwendete Bioreaktor war nahezu identisch mit dem zuvor beschriebenen20, wie in Abb. 3a dargestellt. Der Injektor (Rheodyne) wurde 120 cm von einem erwärmten Reservoir mit frischen KH-Salzen, ergänzt mit 5 mM 12C-Glucose, an die Einlassleitung angeschlossen und mit einer 15-ml-Injektionsschleife aus Polyethylenrohr (1,19 mm Innendurchmesser, Clay Adams) ausgestattet. Die Schleife enthielt KH-Salze, ergänzt mit 5 mM 13C-Glucose, was einen ununterbrochenen Übergang zum markierten Medium ermöglichte. Sobald die Kügelchen gegossen und in das NMR-Röhrchen überführt wurden, wurden die Zellen mit 12C-Glukose in KH-Medium äquilibriert, damit sich die Kügelchen in ihrer endgültigen Position innerhalb des NMR-Röhrchens absetzen konnten und vor der Einführung von ein metabolischer Steady-State hergestellt wurde 13C-Glucose-Medium. 31P-Spektren wurden vor der Einführung des markierten Mediums und am Ende des Experiments gesammelt, um die Energieladung der Zellen zu beurteilen. Das Injektorventil wurde umgeschaltet, um den Impuls des markierten Mediums auszulösen. Der markierte Metabolit wurde durch den kontinuierlichen Fluss des unmarkierten Mediums verjagt. Der Durchfluss wurde in 1,8-ml-Schritten gesammelt, um den Zellaustritt und den Metabolitexport aus den Zellen durch separate Aufnahme von HSQC-Spektren zu bewerten.

Alle NMR-Spektren wurden bei 300 K mit einem 600-MHz-Avance-III-NMR-Spektrometer aufgezeichnet, das mit einer QCI-P-Kryosonde (Bruker) ausgestattet war. Eindimensionale 13C-Isotopen-editierte 1H-Spektren wurden mit 32 Scans unter Verwendung von 13C-editierten heteronuklearen Einzelquantenkohärenz-Experimenten (HSQC, Experiment43) erfasst. Die spektralen Breiten in der 1H- und 13C-Dimension betrugen 16 bzw. 80 ppm und wurden durch 2048 bzw. 1 Punkte in der 1H- bzw. 13C-Dimension digitalisiert. Die Aufnahmezeit für jedes transiente Spektrum betrug 47 s. Für jedes Experiment wurde vor der Injektion der 13C-markierten Glucose ein mit 13C-Isotopen bearbeitetes 1H-Spektrum aufgenommen, um einen Basiswert der in der Probe vorhandenen Metaboliten zu ermitteln. Nach der Injektion wurden über einen Zeitraum von 5,5 Stunden nacheinander 500 Spektren gesammelt, um die Verteilung der 13C-Glucose auf ihrem Weg durch verschiedene Stoffwechselwege zu überwachen. Ein zweidimensionales 13C-1H-Korrelationsspektrum wurde mit 32 Scans unter Verwendung eines 13C-bearbeiteten HSQC-Pulsprogramms43 erfasst. Die spektralen Breiten in den Dimensionen 1H und 13C betrugen 16 bzw. 80 ppm und wurden durch 2048 bzw. 512 Punkte in den Dimensionen 1H und 13C digitalisiert.

Vor jedem Versuch wurde ein protonenentkoppeltes 31P-Spektrum mit 5-k-Scans und einer Recyclingverzögerung von 1 s aufgenommen, um die Beurteilung des Stoffwechselzustands der Zelle zu ermöglichen. Das 31P-Spektrum war bei −10 ppm zentriert, was 242,935 MHz entspricht, und die spektrale Breite in der 31P-Dimension betrug 30 ppm. Die 31P-Peakintensität bei – 11,5 ppm enthält α-ATP, α-ADP, NAD+ und NAD(H), allesamt lebenswichtige Metaboliten, die zur Beurteilung der Zellvitalität verwendet werden können20. Alle Spektren wurden mit Topspin Version 3.2 (Bruker) verarbeitet.

Für die Stoffwechselstudien wurden 1H-13C-HSQC-Spektren mit Topspin (v3.2, Bruker) und MatLab unter Verwendung interner Skripte (Supplementary Methods) verarbeitet. Die Peakintensitäten wurden wie folgt berechnet: I = (I/HEPES)–(Iref/HEPESref), wobei I/HEPES die normalisierte Peakintensität vor der Subtraktion des Hintergrunds Iref/HEPESref darstellt und HEPES die Peakintensität von HEPES bei 3,08 ppm ist. Die Anzahl der einzelnen HSQC-Experimente in der Reihe wurde mit einer entsprechenden normalisierten Intensität für Glutamat, Alanin und Laktat bei 2,28, 1,41 bzw. 1,26 ppm indexiert. Dies wurde in GraphPad Prism aufgezeichnet, um eine XY-Visualisierung des Pulses/Peaks des mit 13C ergänzten Mediums für jeden Metaboliten im Verlauf jedes Experiments zu erstellen.

Die Änderung der Intensität jedes Metabolitenimpulses im Laufe der Zeit wurde analysiert. Die Zeiten für die Vorder- und Hinterflanken des Pulses wurden aus exponentiellen Regressionsmodellen ermittelt, die die beste Anpassung lieferten. Das einphasige Assoziationsmodell von GraphPad Prism wurde verwendet, um die 13C-Glukoseintensitäten an der Vorderkante des Pulses anzupassen

und das Einphasenzerfallsmodell wurde verwendet, um die Hinterkante anzupassen

wobei \({\mathrm{Y}}_{\mathrm{o}}\) die anfängliche Intensität eines Peaks zum Zeitpunkt Null ist, Plateau die maximale (für die Assoziation) und minimale (für den Zerfall) Intensität des Peaks ist, K = 1/tRG oder 1/tFG sind die reziproken Anstiegs- bzw. Abfallzeitkonstanten und t ist die Zeit in Sekunden. Da die Konzentration der intrazellulären Glucose, etwa 0,5 mM64, zehnmal niedriger ist als die Glucosekonzentration im KH-Puffer (5 mM), ist der Beitrag der intrazellulären Glucose zum gesamten Glucose-NMR-Signal vernachlässigbar gering.

Für Laktat, Alanin und Glutamat wurde das Zweiphasen-Assoziationsmodell von GraphPad Prism verwendet, um die Intensitäten an der Vorderkante des Pulses anzupassen

wobei K = 1/tP die reziproke Zeitkonstante für die Metabolitenproduktion ist und 0 ≤ x ≤ 1 ein Parameter ist, der den Prozentsatz jeder exponentiellen Komponente der Gesamtanpassung zuordnet. Beachten Sie, dass ARo und AP in Gl. 1 entsprechen x(Plateau –Yo) bzw. (1-x)(Yo – Plateau). Zur Anpassung der Hinterkante wurde das Zweiphasenzerfallsmodell verwendet

wobei K = 1/tC, die reziproke Zeitkonstante für die Metaboliten-Clearance. Beachten Sie, dass AFo und AC in Gl. 2 entsprechen x (Plateau–Yo) bzw. (1-x)(Yo–Plateau). Basierend auf den Anpassungsergebnissen sind die x-Werte in (5) und (6) vernachlässigbar klein (Ergänzungstabelle 7).

An der Vorderkante des 13C-Glucose-Pulses können Änderungen in der Konzentration des freien 13C-markierten Metaboliten A* mit Fluss J und isotopischer Steady-State-Konzentration A über die Zeit t durch ein standardmäßiges kinetisches Flussprofil KFP beschrieben werden , Gleichung65,66, indem die Nichtidealität des 13C-Glukosepulses berücksichtigt und ein phänomenologischer Term f1(A*, t) hinzugefügt wird, der die Möglichkeit beschreibt, dass der Metabolit kovalent oder nichtkovalent an einen zu großen Rezeptor gebunden ist per NMR zu beobachten:

Die Gleichung beschreibt die zeitliche Entwicklung intrazellulärer Metaboliten wie Alanin und Glutamat. Für ausgeschiedene Metaboliten wie Laktat beträgt die Verdünnungsrate DR im ~ 200 µL NMR-Probenahmevolumen V des Bioreaktors F/V67, wobei F, die Durchflussrate des Bioreaktors ~ 200 µL/min beträgt. Die Verdünnungszeit, 1/DR ~ 1 Minute, ist viel kürzer als tP und tC, die charakteristischen Zeiten der Produktion und Clearance markierter Metaboliten. Daher werden extrazelluläre Metaboliten schnell aus dem aktiven Volumen evakuiert und tragen nicht zum beobachteten NMR-Signal bei.

Unter der Annahme, dass der markierte Metabolit in Gegenwart des unmarkierten Gegenstücks einen chemischen Austausch zwischen freien und gebundenen Zuständen durchläuft und dass die Konzentration der gebundenen Metaboliten viel kleiner ist als entweder die Gesamtkonzentration der Metaboliten oder die Konzentration der Bindungsstellen, beträgt die f1(A*, t) Term wird zu 68 (siehe auch Gleichungen (18) und (21)):

wobei K der charakteristische Bindungsparameter und α die charakteristische Bindungsrate ist. Wichtig ist, dass der Term KA* exp(–αt) gegen Null geht, wenn die Zeit unendlich wird, was die Tatsache widerspiegelt, dass keine Nettokonzentrationsänderung aufgrund der Bindung beobachtet wird, wenn das System mit markierten Metaboliten äquilibriert wird. Die Lösung dieser Differentialgleichung erster Ordnung kann durch Einsetzen von Gleichung gefunden werden. (8) in Gl. (7)

und unter Verwendung des Integrationsfaktors IF69

Im Allgemeinen ist die Lösung von (9) nur numerisch möglich. Der Ausdruck für IF wird jedoch vereinfacht, wenn die Metabolitenbindung unspezifisch ist und αt < < 1. In diesem Fall ist die Lösung von Gl. (10) reduziert sich auf

Dabei sind yo1, AoR und A1 Konstanten, die so bestimmt sind, dass sie dem kinetischen Flussprofil an der Vorderkante (Anstieg) des 13C-Glucose-Pulses entsprechen. Beachten Sie, dass tP = 1/(J/A + K) die charakteristische Zeitskala des Anstiegs des NMR-beobachteten Metabolitensignals für die Vorderkante des 13C-Glucose-Pulses ist und numerisch der Zeit entspricht, die benötigt wird, um vom Anfangszustand zum zu gelangen 1/e ~ 0,63 des Sättigungsgrads. Wichtig ist, dass tP kürzer ist als die charakteristische Zeit tch = A/J65,66 für die Änderung der Gesamtkonzentration des markierten Metaboliten. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die intrazelluläre Metabolitenbindung KFP in der NMR-basierten Metabolomik in der Zelle moduliert.

An der Hinterkante des 13C-Glucose-Pulses können Änderungen in der Konzentration eines freien 13C-markierten Metaboliten, A*, auch durch die KFP-Gleichung beschrieben werden, indem die Nichtidealität des 13C-Glucose-Pulses berücksichtigt und addiert wird der phänomenologische Term f2(A*, t) = KA* exp(–αt)

Unter der Annahme, dass die gleiche Bedingung αt < < 1 gilt, ist die Lösung von Gl. (10) reduziert sich auf

Dabei sind yo2, AoF und A2 Konstanten, die so bestimmt sind, dass sie dem kinetischen Flussprofil an der Hinterkante (Fall) des 13C-Glucose-Pulses entsprechen. Beachten Sie, dass die charakteristische Zeit der Clearance im NMR-beobachteten Metabolitensignal, tC = 1/(J/AK), größer als tP ist. In diesem Fall sind die charakteristischen Zeit- und Bindungsparameter tch und K definiert als tch = 2/(1/tP + 1/tC) und K = (1/tP−1/tC)/2. Dieses Ergebnis beweist, dass die intrazelluläre Metabolitenbindung zu einem asymmetrischen KFP in Bezug auf den Anstieg und Abfall des Signals für den 13C-Glucose-Puls führt und dass die In-Zell-NMR den Beitrag der Metabolitenbindung zu Stoffwechselflüssen in lebenden Zellen quantifizieren kann.

Ein Modell der kompetitiven Bindung markierter Metaboliten mit der Konzentration [A*] in Gegenwart unmarkierter Metaboliten mit der Konzentration [A] wurde verwendet, um die Wirkung der Bindung auf die Konzentration frei markierter Metaboliten zu beschreiben68. Dieses System wird durch zwei gekoppelte Geschwindigkeitsgleichungen beschrieben

Und

Dabei sind [A*R] und [AR] die Konzentrationen gebundener markierter bzw. unmarkierter Metaboliten, k1 und k2 sind Ein- und Aus-Geschwindigkeitskonstanten und [R] ist die Konzentration freier Bindungsstellen. Wenn die Gesamtkonzentrationen markierter und unmarkierter Metaboliten und Bindungsstellen [A]tot, [A*]tot bzw. N betragen, dann ist [A*] = [A*]tot − [A*R], [A] = [A]tot – [AR] und [R] = N − [A*R] − [AR]. Wichtig ist, dass [A*]tot + [A]tot = [A]ss, wobei [A]ss die Konzentration eines Metaboliten im Isotopen-Steady-State ist. Im Allgemeinen sind (14) und (15) nichtlineare Differentialgleichungen und können nur numerisch gelöst werden. Wenn jedoch die Konzentration der gebundenen Metaboliten viel kleiner ist als die Gesamtkonzentration der Metaboliten, gilt Gl. (14) und (15) sind linear und können exakt gelöst werden68. Die Lösung hängt von den Anfangsbedingungen ab

wenn [A*R] t = 0 = 0 und

wenn \(\left[ {{\text{A}}^{*} {\text{R}}} \right]_{{{\text{t }} = \, 0}} = {\text{ N k}}_{{1}} {\text{A}}^{*}_{{{\text{tot}}}} /\left( {{\text{k}}_{{1} } \left[ {\text{A}} \right]_{{{\text{ss}}}} + {\text{ k}}_{{2}} } \right)\).

Wichtig ist, dass die Änderung der Konzentration des gebundenen Metaboliten im Laufe der Zeit beschrieben werden kann, indem man (14) und (15) differenziert und das Ergebnis als darstellt

wobei K = N k1 und α = k1 [A]ss + k2. Negatives d[A*R]/dt definiert f1(A*, t) in Gleichung. (7) und entspricht den Anfangsbedingungen [A*R]t = 0 = 0 und positivem d[A*R]/dt definiert f2(A*, t) in Gl. (12) und entspricht der Anfangsbedingung [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2).

Die Gleichungen (14) und (15) sind auch dann linear, wenn die Konzentration der gebundenen Metaboliten viel kleiner ist als die Gesamtkonzentration der Bindungsstellen N. In diesem Fall hängt die Lösung auch von den Anfangsbedingungen ab

wenn [A*R] t = 0 = 0 und

wenn [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). Wichtig ist, dass die Änderung der Konzentration des gebundenen Metaboliten im Laufe der Zeit auch durch Differenzierung von (19) und (20) und Darstellung des Ergebnisses als beschrieben werden kann

wobei K = N k1 und α = k1 N + k2. In diesem Fall definiert negatives d[A*R]/dt f1(A*, t) und entspricht den Anfangsbedingungen [A*R]t = 0 = 0 und positives d[A*R]/dt definiert f2( A*, t) und entspricht der Anfangsbedingung [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2). Numerische Lösungen für Gleichungen. (14) und (15) im allgemeinen Fall, wenn [AR] oder [A*R] mit [A]tot oder [A*]tot vergleichbar sind, sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. Diese Gleichungen können immer mithilfe einer Exponentialfunktion angepasst werden Funktion wie Gl. (18) mit einem R2-Faktor von besser als 0,99, was darauf hinweist, dass eine Exponentialfunktion auch im allgemeinen Fall eine gute Näherung darstellt.

Platten mit sechs Vertiefungen wurden mit 3 × 105 HEK 293T-Zellen in 2 ml Opti-MEM/5 % FBS-Medium ausgesät und 20 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Zehn µL LF in 200 µL OptiMEM wurden in die erste Vertiefung und 5 µg modifizierte Luciferase-mRNA plus 10 µL LF in 200 µL OptiMEM in eine zweite Vertiefung gegeben. Die Transfektionen wurden in einer Wachstumskammer 5 Stunden lang in 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde durch 2 ml vorgewärmtes OptiMEM/5 % FBS ersetzt und die Zellen konnten sich 24 Stunden lang in der Wachstumskammer erholen (28 Stunden Ruhe). Der Vorgang wurde für zwei weitere Vertiefungen wiederholt und die Platte 4 Stunden lang in der Wachstumskammer inkubiert (4 Stunden Pause). Vor dem Ende der 4-stündigen Inkubation wurde Antimycin A, das den Elektronentransportkomplex hemmt, in einer Konzentration von 1,5 µM in eine andere Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Die Vertiefung wurde einmal mit warmem OptiMEM/5 % FBS gewaschen und mit 2 ml des gleichen Mediums aufgefüllt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit Trypsin-EDTA aus den Vertiefungen geerntet und in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und zweimal mit warmem modifiziertem PBS gewaschen, wobei PBS 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 5,5 mM Glucose enthielt. Abschließend wurden alle Vertiefungen 30 Minuten lang in der Wachstumskammer mit 4 μM MitoSOX in modifiziertem PBS gefärbt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, zweimal mit modifiziertem PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden in 80 µL modifiziertem PBS resuspendiert und 10 µL wurden in jede der vier Vertiefungen einer schwarzen 384w-Platte (Nr. 784.086, Greiner Bio-One) aliquotiert. Die Platte wurde auf einem Synergy H1-Plattenlesegerät (BioTek) mit Anregung bei 510 nm und Emission bei 580 nm gelesen. Zehn µL jeder Zellsuspension wurden in 245 µL PBS verdünnt und die Anzahl der Zellen manuell mit einem Hämozytometer gezählt.

Runde Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 15 mm (Ted Pella) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Cell-Tak-Lösung (Corning) beschichtet. HEK 293T-Zellen wurden gezüchtet und wie die ROS-Plattentests mit den folgenden Modifikationen behandelt. Nachdem die Zellen transfiziert, das Medium aufgefrischt und 28 oder 4 Stunden lang ruhen gelassen wurden, wurden alle Vertiefungen durch Zugabe von Mito Tracker Deep Red FM bis zu einer Endkonzentration von 50 nM gefärbt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen und die Zellen mit 400 µL Trypsin/EDTA geerntet, mit 2 ml OptiMEM/5 % FBS neutralisiert, zentrifugiert, zweimal mit modifiziertem PBS gewaschen und in Eppendorf-Röhrchen im gleichen Puffer mit 4 µM resuspendiert MitoSOX. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gewaschen und in 300 µl modifiziertem PBS resuspendiert und zur Befestigung in der Wachstumskammer 20 Minuten lang auf die mit Cell-Tak behandelten Deckgläser gegeben. Eine der Vertiefungen, die nicht transfizierte HEK 293T-Zellen enthielt, wurde mit 1 µM Antimycin-A behandelt. Nach dem Anbringen wurden alle Vertiefungen zweimal mit PBS gewaschen. 300 µl 4 % Formaldehyd wurden zugegeben und die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 37 °C fixiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit 1 μg/ml Hoechst 33.258-Farbstoff in PBS bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläser wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences) auf Objektträger montiert. Die Zellen wurden am nächsten Tag mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy) mit einem 63-fachen Objektiv abgebildet und mit ImageJ (USA National Institute of Health, https://imagej.nih.gov/ij/) analysiert.

Um die statistische Signifikanz zwischen den durchschnittlich aufgelösten Parametern festzustellen, wurden ungepaarte T-Tests mit Prism (GraphPad) durchgeführt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seiner ergänzenden Informationsdatei enthalten.

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Das beschriebene Projekt wurde durch die Auszeichnungsnummern 1P01HL146367-01 und R01GM085006 des US-amerikanischen National Institute of Health unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH wieder.

Fakultät für Chemie, State University of New York, Albany, NY, 12222, USA

Nicholas Sciolino, Sergey Reverdatto, Aaron Premo, Leonard Breindel, Jianchao Yu, Gregory Theophall, David S. Burz und Alexander Shekhtman

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Ann Marie Schmidt & Ravichandran Ramasamy

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NS, DB, AMS, RR und AS haben den Haupttext des Manuskripts geschrieben, SR, AL und TS haben die Abbildungen vorbereitet. 1 und 6, AP vorbereitet Abb. 2, NS, JY und GT vorbereitet Abb. 3, NS vorbereitet Abb. 4 und 5 sowie ergänzende Materialien: Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Alexander Shekhtman.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sciolino, N., Reverdatto, S., Premo, A. et al. Messenger-RNA in Lipid-Nanopartikeln rettet HEK 293-Zellen vor Lipid-induzierter mitochondrialer Dysfunktion, wie durch Echtzeit-Pulse-Chase-NMR, RTPC-NMR und Spektroskopie untersucht wurde. Sci Rep 12, 22293 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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Eingegangen: 22. August 2022

Angenommen: 14. Dezember 2022

Veröffentlicht: 24. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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